页数：74页文件大小：10.58 MB来源： 高级微生物学ppt课件
本课件分两条线索介绍食品中微生物及其产物的测定：一是活性细胞的标准平板计数、显微直接计数、最近似数测定与染色还原计数等培养观测方法；二是阻抗测定、热稳定性核酸酶测定、血清学与荧光抗体法等理化免疫学鉴测手段。
第四章食品中的微生物及其产物的测定
主要内容一、食品中微生物的培养与观测二、理、化、免疫学鉴测法
第一节食品中微生物的培养与观测
现代微生物学的知识和技术使人们能够全面地检测未知的微生物类群，同时发现这些微生物的功能性状及基因多样性。
检测食品中微生物总数的方法通常有4 种：活性细胞的标准平板计数法（SPC）；活性和非活性细胞的显微直接计数法（DMC法）；各种细胞的统计学检测法即最近似数测定法（MPN）；染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数。
一、活性细胞的标准平板计数法（SPC）1.1 传统计数法：标准平板计数法(standard plate count. SPC) 是检测食品中单位质量或单位体积样品在培养基上形成的菌落数，称为菌落形成单位数(colony forming units,)。
是食品工业中检测食品中菌数(含食品中的菌落总数、霉菌、酵母菌数或致病菌数)的最常用的方法。
SPC法大多采用倾注平板(混菌)的方法，也有的采用涂布平板法。都可称稀释平板计数法。涂布平板法的优点在于可检测到热敏性菌体，而在倾注平板法中这些菌在熔融的琼脂培养基中则不能生长。如果要鉴定某种单菌落时，则以涂布平板法较好；
检测严格好氧菌也以涂布法为好；涂布法的主要缺点是涂布物问题和菌落重叠混杂的问题。
平皿菌落(倾注法)计数：
涂布和倾注法
.2 旋转平板法：用一种特制的散布器从平板中心移至外围，将样品涂布在阿基米德旋转平板上，所附备的特殊注射器不断增加散布样品的体积数量，使得在一个平板上的浓度范围达到10000:1。在适当温度下培养，平板中心的菌落浓度较高，边缘的浓度较低。
通过一种特殊的格状计数器对旋转平板的菌落计数。
优点在于：所用的琼脂少，所需的培养皿、稀释液空白、吸管要少，每小时可检测的样品为标准培养法的3-4倍，每小时可涂布50-60个平板，且操作中不需调试。其缺点是，食品样品中的颗粒可能会使注射器的针头堵塞。此法更适合牛乳等液体食品。
在此法中也可应用激光计数器。由于设备较贵，使用机会少。可详见《细菌学分析手册》
过滤膜的孔径通常为0.45 µm，故水和溶质能通过而细菌不能通过膜。将一定体积的样品经膜过滤后收集菌体，再将膜放在琼脂平板或充满选择性培养基的吸收垫上进行培养。对长出的菌落进行计数，或进行DMC计数。在计数时，膜经过适当染色、冲洗和处理，能用显微镜观察计数。
但一张膜只能过滤少量的样品匀液。1.3 膜过滤法
.3.1 直接荧光膜技术（DEFT）：是荧光染色与荧光显微技术的结合，是一种快速的食品微生物检测技术。如用5µm尼龙膜过滤食品样液，滤出液用2ml氚X—100和0.5ml 胰岛素（用于溶解畜肉体的细胞、防膜被堵塞）处理，经一段时间培养后，处理的滤出液用0.6µm孔的核聚碳酸酯膜过滤，然后滤膜用吖啶橙染色，对染色后的菌体进行荧光显微技术计数，将显微计数器每一区域的平均数量相加得到每克细胞数，25～30min 内可得到结果。
可用于肉类和乳制品的计数:用于乳制品计数时，其结果与SPC法和培养直接计数法的结果相似，此法在10min中内可检测出乳制品中的活性G－和全部G十菌，2min 可计算经热处理的乳制品中的微生物（数量少至5700cfu/ml）。
.3.2DEFT—微菌落计数：可用于细胞的直接显微检测，且用于活性细胞的检测。食品匀液经DEFT膜过滤，将膜放在培养基表面恒温培养至微菌落长出。G-培养3h，G十培养6h，在8h内可检测到大肠杆菌、假单胞菌和葡萄球菌，且其数量少至103cfu/g，长出的微菌落必须用显微镜观察。
.3.3防水网格过滤膜过滤技术：是Sharpe和Michaud所发明，可用于各种食品中的微生物检测计数。所用膜为特殊的含有1600个腊质网格的防水膜，每一格中限制微生物的生长和菌落大小。每个膜可通过MPN自动计数，此法可检测的最小细胞数为10cfu/g，在24h 内可得结果，可用于所有cfu的检测。
可用来检测大肠菌群、沙门氏菌、酵母菌、霉菌数。
.3.4 干燥薄膜计数法该方法是3M公司创立发展的，并设计了Perrifilm膜，将两片塑料膜粘在一起，在一边膜上涂布培养基成分和溶于冷水的凝胶剂，可以使用非选择性培养基，并进行好氧培养计数（APCs），若使用选择性培养基则可检测特殊菌群（如检测大肠杆菌），此法是一种标准微生物计数法。
使用时，在两片薄膜中间滴加一滴样品稀释液，通过挤压将菌液分布在营养区，恒温培养后，非选择性培养薄膜的生长菌落呈红色，因为在营养阶段有四唑染料存在。检测大肠杆菌的干燥培养基是采用β—葡糖苷酸酶作为基质，使大肠杆菌菌落周围呈蓝色晕圈与其他菌落相区别开来，其结果与MPN法相似。
由Sharpe和Ki1ahy 所发明。食品的匀液样品与试管中巳熔融琼脂（45OC）混合均匀并稀释。每个样品用3个琼脂管，第一支试管中加入1mL样品，混匀后，取1支灭菌的毛细吸管（最好1滴0.033mL）,吸取0.1mL 液体加入一无菌皿的底部，重复5次，并使5滴液体成行排列。
再用同一吸管在第1支试管中吸取1mL加入第2支试管中混匀，同前操作5滴液体排列在第二行；然后重复操作第三管，平皿中形成第三排5滴。将含有琼脂滴的培养皿恒温培养24h，然后在显微镜下观察微菌落。用此法可检测纯培养物、蔬菜和肉制品中微生物，结果悄高于SPC 法；
但快速，24h 的结果同于SPC 法48h 的结果，且此法不需空白稀释液，每个样品仅使用一个培养皿。1.4 琼脂滴计数法
.5 显微镜菌落计数法是对生长在载玻片上琼脂培养基中的菌落进行计数。将2ml 熔融琼脂培养基与2ml 热牛奶混合，取0.1ml 涂布在4cm2的载玻片上，置36士1℃培养48h，再经硫胺素蓝染色后，在显微镜下观察计数菌落。
.6 稀释摇管法：它是稀释倒平板法的一种变通形式先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植时，需先用一支灭菌针将液体石蜡－石蜡盖取出，再用一支毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落移植。
表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物用稀释摇管法在琼脂柱中形成的菌落照片（从右至左稀释度不断提高,分离厌氧菌用)琼脂柱单菌落稀释摇管法
二、活性和非活性细胞的显微直接计数（DMC法显微镜直接计数法）2.1 涂片染色法显微直接计数法（DMC）中最简单的方法,将0.001mL样品涂布在1cm2的载玻片上，然后固定，用适当染料染色，然后油镜观察、计数。1cm2
优点是，快捷、简便，能对细胞形态进行分析，还可使用荧光技术增强其效果。缺点是，易造成操作人的疲劳，活性细胞和非活性细胞均被计数，食品颗粒与微生物不易区分，微生物的细胞不易分散均匀。
.2 一种改进的载玻片法：该法使用了四唑盐，即2（p—碘苯基—3—p硝基苯基）—5—苯基氯化唑（INT）。操作时，将被检样品稀释液放入经过滤消毒的INT 中在370C条件下水浴10min，然后经0.45µm的膜过滤；滤膜在500C 干燥10min，用棉子油覆盖再观察。
此法适用于细菌和酵母菌的纯培养物。酵母活性细胞经吖啶橙（0.01%）染色后，用荧光显微镜观察可看到桔红色荧光，称为吖啶橙直接计数法（AODC）。
.3 血球计数板法
.4 霍华德霉菌计数法这是1911年B.J.Howard在检测番茄食品时使用的一种载玻片法。需使用一种特殊的载玻片以观察霉菌的菌丝体，不适用于被粉碎的番茄食品。DEFT方法（直接荧光技术）也可用于蒸汽消毒和未经蒸汽消毒的番茄食品的检测，它可代替霍华德霉菌计数法。
三、最近似数测定法(MPN法)此方法于1915年由McCrady发明，实质为统计学方法，结果高于SPC，其可置信度为95%。该法是采取一个样品用3个稀释液梯度，每个梯度的样品稀释液移至3（5）管装有培养基（液体，即乳糖胆盐发酵液）的试管中（共9或15管），经培养和一些辅助措施证实后，查标准MPN表就可得到原样品中微生物数量，这又称为“三步九管法”。
四、染色还原计数法在估算样品中活性微生物数量的过程中使用两种染料—亚甲基蓝和刃天青。染色还原实验中，冷样品的上清液中添加任一种染料的标准溶液，添加亚甲基蓝从蓝色还原为白色；添加刃天青从暗蓝色还原为粉红色或白色。染色还原的时间与样品中微生物的浓度成反比。
刃天青还原检测法在检测熟肉制品时的效果优于生肉，因生肉制品中存在一些还原物质而影响刃天青的还原性能；在牛肉腐败菌的快速检测中，便用刃天青还原无色，进行气味检测，SPC检测等相结合效果极好。
乳品工业中早就应用了染色还原技术来检测原料乳中的微生物质量；优点是简便、快捷和经济，且只有活细胞对染料有还原能力；缺点是，所有的微生物对染料的还原能力都不相同，故此法不适用于含有还原酶的食品，除非经过特殊的处理（如荧光标记）。
如图所示为一块中间开口为1cm2的进行棉拭涂抹取菌的金属板（多为不锈钢材质）。食品加工业中常用的食品表面微生物检测技术有：5. 1 棉拭和棉拭水方法：棉拭方法应用最广泛、最古老的方法，至今在医院和旅馆也常用此法。W.A.Manheimer 和T.Ybanez 进一步研制出棉拭水技术，此法需使用棉花或藻蛋白酸钙。
五、表层微生物的检测
检测时，将灭菌后的模板置于检测样品的表面，暴露出的表面用灭过菌的潮湿的清洗物（棉花或藻蛋白酸钙）彻底擦拭，然后将清洗物放入装有稀释液的试管或三角瓶内（必要时在稀释液中添加中和剂）。在稀释液中的微生物通过适当方法（如SPC法）进行计数。
当使用棉花做清洁物时，微生物必须从纤维中分离出来，即应充分振荡，或用超声仪的能量除去棉花中微生物；当使用藻蛋白酸钙做清洁物时，用六甲基磷酸钠将藻蛋白酸钙进行容解，使微生物悬浮于稀释液中，此处理法的效果优于前者。棉拭水法用于食品和工具、设备表面微生物计数时，简单、快捷、经济。
.2 平板接触培养法：在平皿中倾注15.5-16.5ml的培养基，形成琼脂平板，当平板翻转时，待检食品表面与琼脂平面接触。此法由Gunderson于1945年提出，在1964年得到Hall 和Hartnett 改进。当检测经清洗剂清洗后的表面时，培养基中需添加中和剂（卵磷脂、吐温80等）。
与检测表面接触后，盖上皿盖，经培养后，进行菌落计数。此法仅适用于微生物较分散的表面，而不适合污染严重的表面。
.3 注射琼脂与“琼脂肠”方法：W.Litsky于1955年提出，此后进一步改造完善。此法是将100ml 的注射器除去针头，在其园柱形空管中装满琼脂，通过挤压活塞将琼脂涂布在检测物表面，再将琼脂层切下，放入培养皿中培养，菌落计数。
由Ten Cate 提出的“琼脂肠”方法与之相似，但使用的是塑料管而不是经改造的注射器，可用于检测鲜肉表面和工具表面。这两种检测方法所得结果常低于那些能将菌团打散的方法。
.4 其他表面分析方法：＃直接表面分析方法：将熔融琼脂倾注于检测物表面，凝固后，将琼脂层放入培养皿中培养，计数菌落。适用于表面活性微生物的检测，如用于不锈钢表面对生孢梭菌的内生芽孢的检测。＃黏性薄膜方法：Thomas发明，由Mossel等人成功应用，是将黏性薄膜（如一种称为黏性带的薄膜）贴在检测物表面，再将接触面紧贴于琼脂平板，揭除薄膜后，培养，计数菌落。
在检测木质表面时其效果比棉拭方法差，用于鲜肉表面微生物计数时效果较好。带有培养基的塑料条可用于瓶子表面的微生物检测。
＃超声仪：超声仪被用于表面污染微生物的检测，但测试的表面积必须足够的小而且可以移动，以保证测试面可装入容器中且浸没在液体内。当容器放入超声仪中，能量使微生物分散到液体内。以便采用相应的其他方法进行测数。＃撒布枪：由Clark 设计，是将冲洗液撒布在检测表面，然后将液体接种平板上，使用该设备时需提供空气压力。
在除去鲜肉表面的微生物时，此法比棉拭方法更有效。(2008.3.17.止)
第二节理、化、免疫学鉴测法
一、物理方法：1.1 阻抗及相关方法：早在1899年G.N.Stewart就提出了微生物的电阻抗的测量方法，但到２0世纪70年代才得到应用。阻抗是电路中对交流电流的一种阻碍作用。当微生物在培养基上生长时，它们代谢导电率低的物质后可产生导电率高的物质，因而使培养基的阻抗降低。
当测量肉汤培养基的阻抗时，阻抗曲线与菌种和菌株有关，可以通过添加特殊生长抑制因子鉴定微生物。一些应用的实例如下:
(1) 对蔬菜微生物计数的结果与平板计数结果一致，阻抗的测量需5ｈ，此法适用于奶油糕点、肉食等。(2) 用7ｈ的阻抗检测时间(IDT)或更少，可得到巴氏消毒的牛奶中的微生物的数量，其结果与APC法相同。(3) 在啤酒酿造中，麦芽汁中酵母的生长使阻抗不断升高，而细菌生长过程使阻抗逐渐降低。
(4)、在生牛肉的检测中，48个样品IDT与1g 细菌数量相反，回归率为0.97，肉食品的IDT 为9ｈ。在另一研究中通过阻抗技术检测鲜肉表面的微生物数量，当细胞浓度为107cfu/ml或更高时，检测可在2ｈ内淮确地完成。
(5)、在检测冷冻浓缩桔子汁时，用阻抗技术来区分微生物质量合格的产品(<104cfu/ml)和不合格的产品(>104cfu/ｍl)。依据细菌的断流时间为10.2ｈ，酵母的断流时间为15.8ｈ，468个样品中有96％被正确划分。
(6)、在检测牛肉中的大肠菌时，使用了特殊的培养基，用阻抗技术分析了70个样品，79％的结果与ＭＰＮ法结果相同，且在24ｈ内可检测到少于100~21000cfu/ｇ的细胞数。有一种新设备，不是运用阻抗技术，但其结果与阻抗技术相似，该设备检测微生物产生的光谱变化，并将其记录下来作为光学单位与时间相对起来。
.2流动型血球细胞计数法：是用于悬浮液中细胞计数和各细胞特性检测的技术。其实质是使悬浮细胞一个一个的经流动槽到检测器。射流装置限定了经过检测器的细胞的流速和轨道，可检测的细胞特性有荧光性、吸光性和光散射性。通过使用流动分类器，可根椐各种细胞的特性将其分类，可以测量细胞的1-3种或更多球形特性。
流动型血球计数器和细胞分类器，利用一种或更多种激发源如氩、氪、氦-氖离子激光以及荧光染料可以在1s内检测和鉴定几千个细胞。当使用一种染料时，它的激发光谱必须与激发源的光波长相匹配。
在检测中两种染料可联合使用，例如在总蛋白和DNA含量的测定中，使用两种染料。两种染料必须在同一波长下激发，散发不同的波长，使得每一染料的散射光可分别测量。当流动型血球细胞计数法与荧光标记的抗体相联合时，40ｍin内可以测到牛奶和鸡蛋中的鼠伤寒沙门氏菌，灵敏度可达103cfu/ml。
当经过6ｈ的非选择性富集，牛奶中的检测限度为10cfu/ml，鸡蛋中为1cfu/ｍl。
二、化学方法：2.1 热稳定性核酸酶测定：通过检测食品中的热稳定性核酸酶(DNAse)的含量可以精确计算出金黄色葡萄球菌的数量。因金黄色葡萄球菌的凝固酶与热稳定性核酸酶的产生有密切关系，特别是肠毒素产生菌株。
.2 三磷酸腺苷（ATP）的测定：ATP是所有生命体的主要能源，它在细胞死亡2h后消失，每个细胞中的ATP含量恒定，大约为1018-1017mol/细胞，相应的每105cfu含有４×104mol/L的ATP。
在原核生物中，处于对数生长期的细胞的ATP含量为2～6nmol/mg细胞干重，在瘤胃细菌中，平均细胞质含量为0.31g/细胞，在瘤胃的原生细胞中含量偏高，细胞中ATP的测量和提取方法，可用于各种微生物菌群。一种简单的ATP裣测法是利用荧火虫的荧光素—荧光素酶系统完成的。
当ATP存在时，荧光素酶发光，可用液体发光分光计和照度计测量。荧火虫荧光色素酶的含量与ATP添加量成正比。在医学上实验室进行尿检时，ATP法被作为裣测微生物的一种快速方法。食品中被用作肉制品的微生物检测。
.3 辐射测量法：以14C标记培地中的可代谢物质为基础，微生物在利用这些物质时有14CO２释放，再利用放射能计数器检测。当检测利用葡萄糖的微生物时，通常使用14C-葡萄糖；当检测不利用葡萄糖的微生物时，则使用14C-甲酸盐或1４C-谷氨酸盐。
在处理过程中使用50mL有盖的血清药瓶，内装12-36ｍL含巳标记的可代谢物的培养基。药瓶中可作好氧条件也可充入气体而形成厌氧条件，然后接种样品。药瓶中的预留空间可用于检测14CO２的存在。检测14CO2所须时间与食品中微生物的含量成反比。
.4 荧光和发光法：在食品微生物的培养基中使用的发光和荧光物质有1)、4-methylumbelliferyl-β-D-葡苷酸（MUG）；2)、4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷（MUGal）；3)、4-bromo-4-氯-3-indolyl-β-D-葡糖苷酸（X-GLUC)；
4)、o-nituophenyl-β-D galactopyranoside （OMPG）5)、5-bromo-4-氯-3-indolyl-β-D-gluvuronide （BCIG）；6)、L-alanine-p-nitroanilide（LAPN）
前3 种物质可产生荧光基质，后３种为发光基质。均可在平板培养基、MPN肉汤和膜过滤方法中使用。MUG应用最广泛，它被β-D-葡糖苷酸酶水解释放出有荧光的４-甲基-umbelliferyl部分在长波长紫外光下可检测。大肠杆菌是GUD的主要生产菌。
MUG广泛用于检测大肠杆菌的培地中。某些沙门氏菌和棒状菌也是GUD的生产菌。在检测大肠杆菌的平板培养基中，添加X-GLUC物质500μl/L，培养24h内大肠杆菌产蓝色，但无荧光。ONPG被用于检测水中是否存在大肠杆菌时，如有则试管中培养液成黄色。
BCIG 可使大肠杆菌菌落成蓝色（用100μl/L十二烷基tryptose琼脂培养基，在350C下培养2h，然后在44.50C培养22～24h），而其他微生物不显蓝色。LAPN 用于G一的检测时,是氨肽酶作用于此物质。酶切L-丙氨酸-ｐ-硝基苯胺形成p-硝基苯胺，此黄色物质可通过分光光度计在390 nm 检测。
三、食品微生物的“指纹”识别和鉴定3.1 血清学方法：被广泛应用于G-的检测，如大肠菌和沙门氏菌。在G＋中，血清学方法对李斯特氏菌属的检测极重要。血清学方法的实质是用特殊抗体鉴定同源抗原。如沙门氏菌（始于１940年），用于分类鉴定时，其主要抗原种类有3类：体细胞（菌体或O）抗原（暴露于细胞表面的O多糖侧链，目前巳知的有2324种，其热稳定性很好）；
Ｋ抗原（荚膜部分，热稳定性较差）；Ｈ抗原（在鞭毛的不同位点上，热稳定性较差）。李斯特氏菌有15种O抗原，5种H抗原。
.2 噬菌体类型：是以噬菌体和它的寄主细菌之间的特殊关系为基础的，人们可以用巳知的噬菌体鉴定其特定的寄主细胞。所有的食品病原体都可用噬菌体方法鉴定。大多数噬菌体的溶菌光谱很广，这表明这些微生物的受点较普遍。由于没有溶菌型和血清型同时存在的可能性，O型抗原的决定物质和噬菌体受点结构并不相同。
大多数噬菌体的溶菌光谱很广，这表明这些微生物的受点较普遍。由于没有溶菌型和血清型同时存在的可能性，O型抗原的决定物质和噬菌体受点结构并不相同。
.3 基因（DNA）探针技术：用某微生物的某段DNA序列检测同源DNA或RNA序列。实验中DNA必须与研究菌株发生杂交，探针含有编码特殊产物的基因序列。探针DNA必须通过某种方法进行标记以观察杂交是否发生。常用放射性同位素作为标记物，如32P、３H、125I、14C，其中常用32P。
常用的指示物有碱式磷酸酯酶、过氧化酶、荧光素、半抗原、生物素、毛地黄毒苷。当使用生物素时，要用抗生物蛋白酶、抗生素、发光素来检测。探针技术的典型应用是用限制性核酸酶来制备未知DNA的片段。经过电泳分离得到DNA片段，然后转移至纤维素硝酸盐过滤膜，与标记探针杂交。
经过小心冲洗除去末反应的探针ＤＮＡ，通过自动射线摄影术分析放射性标记物。
菌落杂交中用DNA探针技术，是将目的微生物富集于薄膜上，然后将膜放在琼脂培养基上培养，使微生物菌落直接在薄膜上形成。原平板的复制品形成复制平板，在复制平板薄膜上生长的菌落被直接溶解，释放出核酸，将DNA转为单链。一些DNA被转移至硝酸盐纤维素滤膜，同标记DNA或RNA探针杂交。
传统的DNA菌落杂交技术得到了改进，每一个滤膜可供48个微生物使用，总共可使用60个滤膜。
.4 DNA 扩增法（PCR 多聚酶链反应）：由Kleppe 等人在1971年首先提出，它在食品微生物鉴定中广泛应用。目前应用最多的是由Perkim Elmer-Cetus Corp 的科学家改进的技术。L.B.Mullis 因此而在1993年得到了诺贝尔化学奖。
PCR（polymerase chain reaction，多聚酶链式反应）是以DNA的一条链为模板，在多聚酶的催化下，通过碱基配对使寡核苷酸引物向3‘方向延长合成模板的互补链。
PCR 包括3个反应过程：双链DNA变性（90～950C）成为单链DNA、引物复性（37～600C）同单链DNA互补序列结合、DNA 聚合酶催化（70～750C）使引物延伸。如此经过25～30次循环，产生大量待扩增的特异性DNA 片段，足够用于进一步实验和分析。
此技术中应用了热稳定性ＤＮＡ多聚酶和5，-及3，寡核苷酸引物，经一套扩增技术循环将一个单分子ＤＮＡ扩增降到107分子。然后将扩增ＤＮＡ经琼脂糖凝胶电脉或与放射标记或非标记探针进行southern杂交。
.5 多位点酶电泳方法（MEE）：通过检测一套水溶性胞内酶的电泳迁移率关系来估测各微生物菌株在菌种范围内的遗传关系。菌种的等位基因和遗传变化引起电泳迁移率的变化。由于同一菌种的不同菌株的一些酶具有不同的电泳迁移率，MEE可用于流行病学中菌株的鉴定。
3.6 限制酶分析法：将研究菌体的染色体DNA 用适当的限制性内切酶降解，酶使双链DNA 在特定核苷酸位点断开。使用最广泛的限制性内切酶为EOORI（从大肠杆菌中得到），它可以识别DNA 中的GAATTC碱基序列，并使GA断开；
另一种内切核酸酶是Ehal（从流感嗜血菌中得降到），可识别GYPyPuAC（Py表示任意嘧啶，Pu表示任意嘌呤），Hhal的作用位点为PyPu，它在流行病单核细胞增生李斯特氏菌的研究中有重要作用。
.7 随机扩增多态DNA技术（RAPD）：这是运用PCR 技术得到随机扩增多态DNA，然后经电泳作用得到相应的图谱。将细胞富集悬浮于水中，溶解得到DNA。将10单位的引物和DNA、Tag多聚酶混合，在不断变化的温度中重复PCR循环40多次，然后将产物经过琼脂糖凝胶电泳。
用溴化乙锭染色，形成的带形图谱经摄影分析。纯化的DNA 不需要RAPD分析也不需要事先得知序列数据。RAPD中热循环30次时间＜1.0h，从菌落生长开始降到得降到分析结果大约需要3h。大量的研究者将RAPD 用于单核细胞增生李斯特氏菌菌株的指纹图谱分析。
.8 脉冲场凝胶电泳（PFGE）：需用一种或多种限制性酶将染色体DNA 降解，通过逆向电泳将限制性片段分离，并使片段在琼脂糖凝胶上溶解。传统的凝胶电泳中，电泳方向为一个方向，PFGE 与此相反。PFGE的脉冲时间从1～100s不断变化，这要由电泳分子的大小决定。
交流电场使电泳分子改变电泳方向，电泳图谱是脉冲型的。此方法巳用于食品中一些病原体的指纹鉴定。1994年用此法鉴定出太平洋西北部暴发的出血性肠炎中的大肠杆菌暴发性和偶发性菌株O157:H7为不同菌体。
.9 限制长度多态片段技术（RFLP）：DNA限制长度多态片段是用限制性内切核酸酶溶解DNA时产生的不同长度的DNA片段。细胞内的DNA被限制性内切核酸酶降解，然后经过电泳分离，与一个DNA探针发生Southern杂交与MEE方法相结合，此法可检测鲜牛乳和非乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌菌株。
.10 核酸方法：从细胞中提取DNA，用内切核酸酶如EcoRI降解，然后通过琼脂糖凝胶电泳将片段分离。分离得到的片段转移降到尼龙膜和适当的标记cDNA探针杂交，探针来自逆转录酶作用的rRNA，然后记录化学发光图谱。现已用的自动核酸型分析系统可同时处理8个样品。
四、免疫学方法4.1 荧光抗体法（FA）：创立于1942年。将抗体与荧光物质相结合而带有荧光，当抗体与抗原发生反应时，抗体－抗原体系发出荧光，通过荧光显微镜可以观察。荧光标记物常为若丹Ｂ、荧光异氰酸盐、荧光异硫代氰酸盐。
FA技术可用两种方法，一种为直接法（使用抗原和特殊的与荧光物质结合的抗体，抗原被有荧光标记的抗体包围）；另一种为间接方法，同源抗体并不与荧光物质相连，而使用的同源抗体的抗体与荧光物质相连（抗原被同源抗体包围又被同源抗体的抗体包围，从而带有荧光）。
.2 血清富集技术：由Sperber和Deibel创建，分为四步；在非选择性培养基上预富集18h；在亚硒酸盐-半胱氨酸或连四硫酸盐肉汤培养基中选择性富集24h；在M液中选择性富集6-8h或24h；与多价Ｈ抗血清在500C凝结1h。
结果可在50h内得到（与选择性富集时间有关），而CCM方法（传统沙门氏菌检测法）则需要96-120h。在间接方法中标记物可检测抗体的存在，直接方法中标记物可检测抗原的存在。使用间接方法不用为每一检测微生物制备荧光抗体。如果使用H免疫血清，FA 技术就不需要沙门氏菌的纯培养物。
.3 免疫放射分析：此技术对抗原添加放射性标记，使被标记抗原与它的特殊抗体反应，然后用放射性测量仪检测与抗体相连的抗原的数量。固态放射性免疫测定（RIA）是使单层的抗体分子与固体表面或物质相结合。使用的固态物质有聚丙烯、聚苯乙烯和溴乙酰纤维素。
被抗体包裹的聚合物可与有放射性物质标记的抗原相结合，这是固态RIA技术的关键。当洗去游离的标记抗原后，进行放射性定量测量，研究中使用最多的标记物是125I。
.4 酶连免疫法（ELISA）：典型的ELISA方法中使用固相（聚丙烯）包埋抗原，用抗血清培养。培养后洗涤，加入酶标记的免疫抗体球蛋白，经过洗涤后，分析检测留在试管中的酶，得到在原血清中的特殊抗体数。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶，通过添加过氧化物酶底物可检测酶的存在。
利用酶底物的比色检测可确定酶的数量。
.5 胶体扩散技术：被广泛用于细菌毒素和内毒素的检测和定量。最常的有4种方法：单扩散管（Oudin）方法; 微斜面双扩散方法; 微型Ouchterlony斜面方法;电子免疫扩散方法。
第四章完(2008.3.24.止)
二、活性和非活性细胞的显微直接计数法（DMC法显微镜直接计数法）2.1 涂片染色法:显微直接计数法（DMC）中最简单的方法，将0.001mL 样品涂布在1cm2的载玻片上，然后固定，用适当染料染色，然后油镜观察、计数。1cm2
cm2
.6食品安全性实验大鼠体重周变化率血液生理指标–红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞血液生化指标–碱性磷酸酶、葡萄糖、甘油三脂、胆固醇脏器系数–心、肺、肝、脾、肾
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