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第1页：第四章 DNA的复制 导言页

第四章 DNA的复制

• A gene participates in three major activities：1. Information Storing 2. Replication 3. Accumulating mutations

第2页：遗传信息的储存

遗传信息的储存

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第5页：突变的积累

突变的积累

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第7页：DNA的复制

DNA的复制

第8页：DNA的复制

DNA的复制

（replication）是指以原来的DNA分子为模板合成出相同的DNA分子的过程。

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从Watson

和Crick建立DNA结构的双螺旋模型开始，关于DNA复制的轮廓就已经诞生。

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“Now our model for

deoxyribonucleic acid is,in effect, a pair of templates, each of which iscomplementary to the other. We imagine thatprior to duplication the hydrogen bonds arebroken, and the two chains unwind andseparate. Each chain then acts as a template for

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第12页：DNA复制和细胞周期的关系

DNA复制和细胞周期的关系

• DNA复制是细胞周期的决定因素，DNA复制完成以前，细胞不会发生分裂。
• DNA复制的完成是细胞分裂的触发点，复制后的基因组被平均分配到两个子细胞中去。细胞周期调控基因控制DNA的复制并触发细胞分裂。

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第16页：第一节DNA的复制概况一

第一节DNA的复制概况一

DNA的复制机制DNA分子的碱基互补配对原则是DNA分子结构的基础，这个原则在DNA的复制过程中也起着重要的指导作用。理论上，DNA的复制可以采取半保留复制、全保留复制和混合复制（散布式）三种方式。

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第20页：半保留复制机制

半保留复制机制

的证明—Meselson-Stahl实验

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第24页：半保留复制

半保留复制

是双链DNA普遍采用的复制机制。即使是单链DNA分子，在其复制过程中也要先形成双链的复制形式。半保留复制机制说明了DNA在代谢上的稳定性。

第25页：二、DNA复制的起点、方向和方式

二、DNA复制的起点、方向和方式

DNA复制的起点原核生物DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点，常用ori来表示。原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。

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第28页：将一段来自起点

将一段来自起点

的DNA序列与缺失起点的DNA分子克隆到一起，如果来自起点的DNA片段包括一个复制起点所必须具备的序列，它将支持与其连接的任何DNA序列的复制。由此可以鉴定起点的DNA序列。

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第30页：真核生物DNA的复制

真核生物DNA的复制

也是从特定的位点开始的，以双向延伸的方式进行，直到终点为止。真核生物DNA的复制是从多个位点开始的，所以真核生物的DNA分子上有多个复制单位同时进行DNA的复制。

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第32页：复制子（replicon）复制子

复制子（replicon）复制子

是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。

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第35页：原核生物细胞的基因组只有一个复制子

原核生物细胞的基因组只有一个复制子

细菌内的质粒是一个自主复制的环状DNA基因组，构成一个独立的复制子。真核生物的DNA分子上有多个复制子。

第36页：参与复制的DNA分子上有两个区域

参与复制的DNA分子上有两个区域

未复制的区域由亲代DNA组成，已复制的区域由两条子代链组成。复制正在发生的位点叫做复制叉（replicationfork）或生长点（growing point）。

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第38页：DNA复制的方向

DNA复制的方向

复制可单向进行，也可以双向进行，这取决于在起点有一个还是两个复制叉。

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第41页：DNA复制的方式

DNA复制的方式

• 大多数生物体内DNA的复制都以双向等速方式进行。但枯草杆菌两个复制叉的移动是不对称的。质粒ColEI的复制完全是单向进行的。
• 大多数生物体内的DNA复制都以对称方式进行，即DNA分子的两条链同时复制。但也有在一定时期内DNA只复制一条链的情况。例如线粒体的D－环复制和一些细菌噬菌体的滚环复制方式。

第42页：三、DNA聚合酶与DNA聚合反应

三、DNA聚合酶与DNA聚合反应

DNA的复制是由DNA聚合酶（DNA polymerase）负责完成的，它具有按照模板的指令在模板链上催化新DNA链合成的活性。DNA聚合酶是一种模板指导的聚合酶，产物DNA与模板的碱基组成相同。说明在DNA聚合酶的作用下，DNA的两条链都能复制。

第43页：在适量DNA和镁离子存在下，DNA聚合酶

在适量DNA和镁离子存在下，DNA聚合酶

催化4种脱氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3’-OH末端

第44页：四、复制的基本过程

四、复制的基本过程

• DNA的复制包括起始、延伸和终止三个步骤。
• 复制调控主要发生在起始阶段，复制子增殖依赖于起始过程起点处发生的相互作用。一般复制开始后，就会进行到底，直到整个基因组都复制完毕。

第45页：五、DNA复制的半不连续性

五、DNA复制的半不连续性

• 当复制叉前进时，在两个暴露的亲链上都要进行子链的合成。
• 但是DNA分子的两条链是反向平行的，而且所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，即新生链的方向只能是5’→3’。DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?

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第47页：In 1968

In 1968

Reiji Okazakiconcluded that DNAreplication in E. coli (and in other organism)issemidiscontinuous. One strand (leadingstrand

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第52页：第二节DNA的复制体系一

第二节DNA的复制体系一

复制体系的鉴定人们一般通过突变体表型的变化来考察基因的功能，如果某个基因突变导致细胞DNA不能复制，就可以说这个基因与DNA复制有关。利用大肠杆菌的温度敏感突变体已经鉴定了一系列的dna基因座。

第53页：对参与DNA复制

对参与DNA复制

的蛋白质进行识别和鉴定的方法有三种：纯化、突变、重建。

第54页：二、DNA聚合酶1大肠杆菌

二、DNA聚合酶1大肠杆菌

的DNA聚合酶大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。DNA聚合酶Ⅰ参与损伤DNA的修复，并在半保留复制中起切除RNA引物的作用。DNA聚合酶Ⅱ也参与修复。DNA聚合酶Ⅲ是一个多亚基的蛋白质，是合成DNA新链的主要复制酶。

第55页：DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它是由polA基因编码的103 kDa的单链多肽。当底物和模板存在时，DNA聚合酶Ⅰ可使脱氧核糖核苷酸依次加到具有3’－OH末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链（DNA或RNA）的存在。

第56页：DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ

• DNA链沿5’→3’方向的延长（DN
• 从3’端水解DNA链（3’→5’外切
• 从5’端水解DNA链（5’→3’外切

第57页：用蛋白水解酶将DNA聚合酶Ⅰ作有限水解

用蛋白水解酶将DNA聚合酶Ⅰ作有限水解

可得到分子量为68 kDa和36 Kda的两个片段。大片段（68KDa，也叫Klenow片段）在体外它可以催化合成反应。Klenow片段C端的2/3片段具有聚合酶活性，而N端的1/3片段具有3’→5’外切核酸酶活性。两个活性位点的距离为3 nm，表明碱基的加入和去除功能在空间上是分开的。

第58页：小片段（35 KDa）

小片段（35 KDa）

有5’→3’外切核酸酶活性，可以切除少的核苷酸。该酶片段在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用。DNA的半不连续合成中，岗崎片段5’端RNA引物的切除可能也依赖于该外切酶活性。

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第60页：小片段的外切酶活性和大片段的聚合校

小片段的外切酶活性和大片段的聚合校

对功能协同作用，使DNA聚合酶Ⅰ具有从切口处起始复制的独特功能。在双链DNA的磷酸二酯键断裂（nick）处，DNA聚合酶Ⅰ可延伸3’末端，合成新的DNA片段后，置换双螺旋中已有的同源链（切口移位）。

第61页：体外的切口移位（nick translati

体外的切口移位（nick translation）

是实现在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的重要技术。

第62页：DNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅱ

是一条分子量为120,000的多肽链。这个酶的活性很低，只有DNA聚合酶Ⅰ的5％。DNA聚合酶Ⅱ也以4种脱氧核糖核苷酸为底物，从5’-3’方向合成DNA。DNA聚合酶Ⅱ具有3’-5’外切核酸酶活性，但无5’-3’外切酶活性。DNA聚合酶Ⅱ在DNA的修复中起一定作用。

第63页：DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ

DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ

是真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶。DNA聚合酶Ⅲ是多亚基组成的蛋白质。DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、δ’、χ和ψ10种不同的亚基组成。

第64页：DNA聚合酶Ⅲ至少含有3种重要的酶活性

DNA聚合酶Ⅲ至少含有3种重要的酶活性

即5’→3’DNA聚合酶活性、3’→5’外切核酸酶活性和依赖DNA的ATP酶活性。DNA聚合酶Ⅲ不具有5→’3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶Ⅲ全酶在细胞中的含量很少，在每个细胞中只有10－20个拷贝的全酶（holoenzyme）。

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第66页：DNA聚合酶Ⅲ含有以下4个不同的功能组分

DNA聚合酶Ⅲ含有以下4个不同的功能组分

1）核心聚合酶（core polymerase）核心聚合酶由α、ε、θ三种亚基组成。α亚基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。ε亚基具有3’-5’外切核酸酶的校对功能，控制复制的忠实性。ε亚基与α亚基形成一个紧密的1：1复合物，协同发挥作用。θ亚基促进ε亚基的作用。

第67页：2）β二聚体β亚基

2）β二聚体β亚基

是以二聚体的形式存在的。β二聚体是环状的，环绕着DNA并在DNA自由滑动，构成一个滑动钳。滑动钳可以把全酶束缚在模板DNA上，从而保证高度的进行性。钳的存在对于大肠杆菌的高效复制是十分必要的。

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第70页：3）γ复合物γ复合物含有5种不同的亚基

3）γ复合物γ复合物含有5种不同的亚基

形成一种化学计量为γ2δ1δ’1χ1ψ1的结构。γ复合物是β滑动钳的载体，它可以帮助β滑动钳结合到DNA上。γ复合物有依赖DNA的ATP酶活性。β二聚体自己并不能组装到DNA上，它是通过γ复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的。

第71页：γ复合物

γ复合物

是一个不对称的结构，它们相对两个核心聚合酶不对称分布使全酶具有不对称结构，导致在全酶上两个核心聚合酶功能上的不对称性。

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第73页：4）τ二聚体连接蛋白（τ2）可结合两个核心酶

4）τ二聚体连接蛋白（τ2）可结合两个核心酶分子和一个γ复合物

τ亚基是一个依赖于DNA的ATP酶，τ二聚体可结合两个核心酶，每个τ亚基结合一个核心酶。在一个分子结构中存在两个聚合酶表明复制性的聚合酶成对起作用，协同复制双螺旋DNA的两条链。

第74页：DNA聚合酶Ⅲ全酶

DNA聚合酶Ⅲ全酶

• 的功能是复制大肠杆菌的染色体
• DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅰ的不同之处：DNA聚合酶Ⅲ具有多亚基的结构。聚合反应需要ATP的存在。反应有很高的速度和高度的进行性。

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第81页：2 DNA复制的忠实性

2 DNA复制的忠实性

• 复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息准确传递的一个必要条件，它取决于碱基配对的专一性。
• DNA聚合酶可以通过两种方式提高互补碱基选择的专一性。

第82页：第一

第一

通过专一性识别使即将加入的碱基与模板的碱基严格互补，这种方式用来控制合成前的错误。

第83页：不同的聚合酶

不同的聚合酶

• 以不同的方式处理聚合与校对的关系
• DNA聚合酶在复制过程中造成的错误除了不正确配对造成的核苷酸取代外，还包括由于插入或缺失额外的核苷酸造成的框架移位。

第84页：3其他生物的聚合酶噬菌体

3其他生物的聚合酶噬菌体

也编码DNA聚合酶，它们是T4、T5、T7、SPIO1。这些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。真核生物中发现了5种不同的DNA聚合酶，分别为α、β、γ、δ、ε。α、β、δ、ε位于细胞核中，而γ是线粒体酶。

第85页：4 DNA聚合酶的引物

4 DNA聚合酶的引物

• DNA聚合酶的一个共同特征是它们只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3’－OH上，而不能从游离核苷酸起始DNA链的合成。DNA聚合酶需要引物来提供3’－OH末端，然后在其上加入核苷酸来延伸DNA链。
• 通常细胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通过DNA聚合酶延伸RNA链的3’－OH。

第86页：The first line of

The first line of

evidence supporting RNApriming was the finding thatreplication ofM13 phage DNA by an E. coli extract isinhibited by the antibiotic rifampicin. This is

第87页：Perhaps the best

Perhaps the best

evidence for RNA priming wasthe discovery thatDNase cannot completelydestroy Okazaki fragments. It leaves little piecesof RNA 10-12 bases long.

第88页：5 DNA聚合酶

5 DNA聚合酶

催化的分子机制来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构，存在相似的折叠结构。

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第90页：通过晶体结构和模型研究发现

通过晶体结构和模型研究发现

手指区域可与未复制的单链模板相互作用，同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。拇指亚区可与模板－引物DNA双螺旋相互作用。聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的会合点，并与dNTP相对。

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第92页：研究还发现

研究还发现

dNTP的进入伴随着两个Mg2＋离子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反应的双金属离子机制（twometal-ion mechanism)。

第93页：三、DNA连接酶

三、DNA连接酶

DNA聚合酶只能催化多核苷酸链的延长反应，不能使链与链之间连接。DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’－磷酸基和3’－羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP作为能量来源。

第94页：四、螺旋酶

四、螺旋酶

• 在DNA复制、修复、重组以及接合过程中，DNA两条互补链必须部分分开以形成单链DNA中间体，即解旋。该过程是由DNA螺旋酶催化完成的。
• DNA螺旋酶(helicase)是DNA复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白。
• 螺旋酶具有依赖DNA的ATPase活性，可把ATP水解产生的自由能转化为解旋DNA并使螺旋酶本身沿

第95页：DNA螺旋酶都以寡聚体的形式发挥功能

DNA螺旋酶都以寡聚体的形式发挥功能

通常是二聚体或六聚体。每一个亚基具有一个潜在的DNA结合位点，从而每个螺旋酶分子具有多个DNA结合位点，这是螺旋酶实现催化功能的关键。

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第97页：五、DNA拓扑异构酶

五、DNA拓扑异构酶

• 复制过程中，DNA双螺旋的解旋使复制叉前面产生正超螺旋，将妨碍复制叉的前进。DNA拓扑异构酶则可以使超螺旋分子松弛。
• 大肠杆菌中起主要作用的是拓扑异构酶Ⅱ，它能够产生负超螺旋以抵消复制叉移动所产生的正超螺旋，防止正超螺旋的积累，使DNA片段以负超螺旋的形式存在。

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第99页：六单链结合蛋白

六单链结合蛋白

（single-strand bindingprotein，SSB）

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