页数：71页文件大小：6.47 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件系统讲授DNA复制与修复，先以Meselson-Stahl实验证明半保留复制，再说明复制起点方向、半不连续复制与冈崎片段，随后介绍DNA聚合酶、解链酶、引物酶等复制相关蛋白质与大肠杆菌复制过程，最后展开错配修复、切除修复等修复途径。
第三章 DNA的复制与损伤修复（Replication and Repair of DNA）
本章主要内容
目的要求
1953年Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。1964—1970年发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录；RNA的复制存在于RNA病毒。
DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。
Reverse transcription，中心法则图示：展示DNA复制、转录生成RNA、翻译生成蛋白质，以及逆转录由RNA生成DNA的信息流动路径。
DNA复制的可能方式：
DNA半保留复制图示：亲代双链解开后，每条链作为模板按碱基互补原则合成新链，子代DNA分子各保留一条亲代链。
半保留复制的证明：Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。
15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度，因此在氯化铯密度梯度离心后可形成位置不同的条带。
本页源文件仅提取到页码数字，无正文内容，实为图示页，疑为氯化铯密度梯度离心条带照片或示意，建议对照原课件图片补充描述。
| 世代 | 杂合双链（15N～14N） | 轻双链（14N～14N） |
|---|---|---|
| 亲代 | — | 0（全为15N～15N） |
| 子一代 | 全部 | 0 |
| 子二代 | 1 | 1 |
| 子三代 | 1 | 3 |
| 子四代 | 1 | 7 |
实验中还设置亲代DNA与子二代DNA的混合物、亲代DNA与子四代DNA的混合物作为对照。
复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图：显示环状DNA分子在复制过程中形成的θ结构及复制叉位置。
DNA的半保留复制的生物学意义：
双向复制与单向复制：图示两种复制方式下复制叉自起点向一侧或两侧推进的差异。
二、DNA复制的起点与方向
DNA复制的主要方式
三、DNA复制的半不连续性
半不连续复制的发现（1968年日本学者冈崎）：同位素实验用含3H的dT标记T4噬菌体感染的大肠杆菌，短时间内分离的DNA均为小片段，一段时间后检测到DNA大片段；当使用DNA连接酶缺失的变异株时，检测到大量DNA片段的积累，证明DNA复制中有小片段合成。
测定DNA小片段远远大于合成DNA的一半，似乎两条链都是不连续合成的，后发现是由于U替代dT渗入DNA中而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变株中，DNA的U不再被切除，则检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中，从而证明半不连续复制。
四、与DNA复制有关的酶和蛋白质
（一）DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。
（二）大肠杆菌DNA聚合酶
1、DNA聚合酶Ⅰ：1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离，为单体酶，含一个锌原子，是具有多种功能的多功能酶：
该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要参与DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其缺口的填补。
DNA聚合酶催化的反应：在引物3'-OH末端与 incoming 脱氧核苷三磷酸之间形成磷酸二酯键，同时释放出焦磷酸。
DNA聚合酶Ⅰ的功能：利用5'→3'外切酶活性切除RNA引物，同时以聚合酶活性填补留下的缺口，最后由DNA连接酶连接切口。
Arthur Kornberg（1918—），Stanford University，Stanford, CA, USA。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959：“for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid”。
2、DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，具聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高，持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3'→5'外切酶活性，其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。
3、DNA聚合酶Ⅲ：多亚基酶，含十种亚基（α、β、γ、θ、τ、δ、δ'、χ、Ψ、ε），其中（α、ε、θ）称为核心酶，β2称为夹子，（γ2、δ、δ'、χ、Ψ）组成γ复合物，其主要功能是帮助β亚基夹住DNA，故称为夹子装配器。该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外该酶合成速度大、活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死，因此认为该酶是DNA的真正复制酶。
| 亚基 | 相对分子量 | 亚基数目 | 基因 |
|---|---|---|---|
| α | 132000 | 2 | dnaE |
| ε | 27000 | 2 | dnaQ |
| θ | 10000 | 2 | holE |
| τ | 71000 | 2 | dnaX |
| γ | 52000 | 2 | dnaX |
| δ | 35000 | 1 | holA |
| δ' | 33000 | 1 | holB |
| χ | 15000 | 1 | holC |
| Ψ | 12000 | 1 | holD |
| β | 37000 | 4 | dnaN |
说明：α、ε、θ构成核心酶，β2为夹子，γ、δ、δ'、χ、Ψ组成γ复合物（夹子装配器）。
DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体：全酶含两个核心酶，分别负责前导链的合成与滞后链的合成，实现两条链在同一复制体中的协同延伸。
DNA聚合酶Ⅲ的β-钳子俯视图：β亚基二聚体呈环状套在DNA双螺旋上，使聚合酶与模板保持结合而不脱落，从而赋予极高的持续合成能力。
| 项目 | DNA聚合酶Ⅰ（Pol A） | DNA聚合酶Ⅱ（Pol B） | DNA聚合酶Ⅲ（Pol C） |
|---|---|---|---|
| 结构基因 | polA | polB | polC |
| 不同种类的亚基数目 | 1 | ≥7 | ≥10 |
| 相对分子质量 | 103,000 | 88,000 | 830,000 |
| 3'→5'外切酶 | ＋ | ＋ | ＋ |
| 5'→3'外切酶 | ＋ | － | － |
| 聚合速度（核苷酸/分） | 1,000-1,200 | 2,400 | 15,000-60,000 |
| 持续合成能力 | 3-200 | 1,500 | — |
| 功能 | 切除引物、修复 | 修复 | 复制 |
说明：原文“持续合成能力”一栏中DNA聚合酶Ⅲ的数值缺失，以“—”占位，建议对照原课件核对。
DNA连接酶作用机理：连接酶先以ATP（或NAD+）活化自身形成酶-AMP复合物，再将AMP转移至切口5'-磷酸端，最后由3'-OH亲核进攻形成磷酸二酯键并释放AMP。
（四）与DNA合成有关的其它蛋白因子（大肠杆菌中）：
| 蛋白质 | 功能 | 相对分子量（×103） |
|---|---|---|
| DNA旋转酶（或拓扑异构酶） | 引入或松开超螺旋 | 400 |
| DNA解链酶 | 使双链DNA解链 | 65 |
| 单链结合蛋白 | 稳定单链区 | 74 |
| 引物合成酶 | 合成RNA引物 | 60 |
| DNA聚合酶Ⅰ | 除去引物并填满缺口 | 109 |
说明：原表另有一栏“分子/细胞”，因原文数字粘连无法可靠拆分，未予还原，建议对照原课件补全。
1、拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组、修复和其它转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。
本页源文件仅提取到页码数字，无正文内容，实为图示页，疑为拓扑异构酶切断与重接DNA链的作用示意图，建议对照原课件图片补充描述。
3、引物合成酶与引发前体
（五）参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图：展示解螺旋酶、单链结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶Ⅲ全酶与DNA连接酶等在复制叉处的空间分布与协作关系。
五、DNA的复制过程（以大肠杆菌为例）
（一）复制起始
本页源文件仅提取到页码数字，无正文内容，实为图示页，疑为复制起始复合物或复制眼形成过程示意图，建议对照原课件图片补充描述。
（二）链的延长（冈崎片段的合成）
DNA链的延伸：在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种5'-脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3'端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成，两条链方向相反。
冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接：由DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性切除RNA引物并填补缺口，最后由DNA连接酶连接切口，使相邻冈崎片段连成完整的滞后链。
前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶Ⅲ的异二聚体催化）：同一全酶中的两个核心酶分别负责前导链的连续延伸与滞后链的不连续合成。
本页源文件仅提取到页码数字，无正文内容，实为图示页，疑为DNA聚合酶Ⅲ异二聚体合成前导链与滞后链的示意图，建议对照原课件图片补充描述。
（三）复制的终止：顺时针终止陷阱与逆时针终止陷阱。Ter：终止陷阱，引起复制终止的特定区域，为20 bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。
大肠杆菌DNA复制的终止：两个反向推进的复制叉在终止区域相遇，Tus蛋白结合于Ter序列阻止复制叉继续前进，最终完成子代染色体的分离。
（四）DNA复制的精确性（高保真复制）：DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109~1/1010，即每109~1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000~10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性主要与下列因素有关：
六、复制起始的时序控制
七、真核生物DNA复制的特点
| 项目 | DNA聚合酶α | DNA聚合酶β | DNA聚合酶γ |
|---|---|---|---|
| 定位 | 细胞核 | 细胞核 | 线粒体 |
| 亚基数目 | 4 | 1 | 2 |
| 外切酶活性 | － | － | 3'→5'外切酶 |
| 引物合成酶活性 | ＋ | － | － |
| 持续合成能力 | 中等 | 低 | 高 |
| 抑制剂 | 蚜肠霉素 | 双脱氧TTP | 双脱氧TTP |
| 功能 | 引物合成 | 修复 | — |
说明：原表还列出DNA聚合酶δ与ε，但源文件中这两列数据缺失，且γ的功能项未给出，均以“—”占位，建议对照原课件补全。
真核细胞DNA复制示意图：显示线性染色体上多个复制起点形成多个复制眼，各复制眼双向延伸直至相邻复制子融合。
八、DNA损伤的修复
主要形式：
DNA在复制时产生错配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，都可能使DNA的结构及功能发生改变，从而引起生物突变，甚至导致死亡。
DNA突变可能导致肿瘤的发生：
通常生物体DNA的损伤有一系列的修复机制，如：错配修复、碱基的切除修复、核苷酸的切割修复、直接修复、重组修复等。
（一）错配修复。参与错配修复的酶与蛋白质：Dam甲基化酶；MutH、MutL、MutS蛋白；解螺旋酶Ⅱ；DNA聚合酶Ⅲ；外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶；DNA连接酶；SSB。
错配修复过程（高度耗能）：
本页源文件仅提取到页码数字，无正文内容，实为图示页，疑为错配修复中MutS/MutH/MutL作用的流程图，建议对照原课件图片补充描述。
（二）碱基的切除修复
（三）核苷酸的切除修复：由DNA解螺旋酶参与，识别并切除含损伤碱基的一段寡核苷酸，随后由DNA聚合酶填补、连接酶封口。
核苷酸切除修复过程：uvrA、uvrB蛋白结合于损伤部位，uvrB产生3'-端切口，uvrC产生5'-端切口，uvrD（解螺旋酶）将损伤的寡核苷酸片段切除，随后由DNA聚合酶Ⅰ或Ⅱ填补，DNA连接酶连接。此外，光解酶可直接修复紫外造成的嘧啶二聚体。
（四）直接修复（1）：直接修复无须切除碱基或核苷酸，而是通过酶促反应直接逆转损伤，典型代表为光复活酶对嘧啶二聚体的修复。
直接修复（2）：O6-methylguanine-DNA methyltransferase 以其半胱氨酸残基（Cys-SH）接受DNA上O6-甲基鸟嘌呤的甲基，使碱基恢复原状；该酶同时是其自身基因的转录激活因子。DNA上的O6-甲基鸟嘌呤即通过Cys移除甲基而被直接修复。
（五）重组修复（发生在复制后）：复制时跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除，但在后代逐渐稀释。
（六）SOS反应和诱导修复（易错修复）
SOS反应包括：避免差错的修复能力增强；诱导产生无校正功能的DNA聚合酶；合成抑制细胞分裂。SOS反应是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能；对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。
（Replication and Repair of DNA）完——DNA复制与修复。
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