07 真核生物基因表达的调控.ppt

第1页：第八章化学修饰与基因表达封面

第八章 DNA或蛋白质的化学修饰与基因表达

第2页：本章主要内容

本章主要内容

• 一、DNA甲基化与基因表达
• 二、蛋白质磷酸化与基因表达
• 三、基因重排的分子机制

第3页：DNA甲基化的主要形式

一、DNA甲基化与基因表达：DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

1、DNA甲基化的主要形式：5-甲基胞嘧啶，N⁶-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中；原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。

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第6页：日常型与从头合成甲基转移酶

真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：

• 一种被称为日常型（maintenance）甲基转移酶，主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。
• 另一种是从头合成（de novo synthesis）甲基转移酶。

日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。Ⅱ类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而Ⅰ类和Ⅲ类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。

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第9页：CpG岛与CpG序列的丢失

由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以高等真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CG islands，大多位于转录单元的5'区。

没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，它就变为T，无法被区分。因此，CpG序列极易丢失。

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第11页：甲基化抑制转录的机制概述

2、甲基化抑制基因转录的机制：甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。

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第16页：甲基化密度与启动子强度的平衡

对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较高时，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1（methylCpG-binding protein 1）结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。

DNA甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。随着个体发育，当需要某些基因保持“沉默”时，它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则去甲基化。

第17页：直接机制与间接机制

• Ⅰ. DNA甲基化抑制基因转录的直接机制：某些转录因子的结合位点内含有CpG序列，甲基化以后直接影响了蛋白质因子的结合活性，不能起始基因转录。
• Ⅱ. 甲基化抑制转录的间接机制：CpG甲基化通过改变染色质的构象或者通过与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合。

第18页：甲基化DNA结合蛋白MeCP1/2

与不含甲基化的染色质相比，甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，说明甲基化与非甲基化DNA在构象上有差异。

已经分离纯化了数个与甲基化DNA特异结合的蛋白质。MeCP1可以与至少12个对称的甲基化CpG结合，而MeCP2仅同单个甲基化的CpG序列结合。

第19页：DNA甲基化与X染色体失活

3、DNA甲基化与X染色体失活：雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。

第20页：Xist基因与X失活中心Xic

科学家发现，在X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位称为X染色体失活中心（X-chromosome inactivation center，Xic），定位在Xq13区（正好是Barr氏小体浓缩部位）。Xi-specific transcript（Xist）基因只在失活的X染色体上表达，其产物是一功能性RNA，没有ORF却含有大量的终止密码子。实验证明，Xist RNA分子能可能与Xic位点相互作用，引起后者构象变化，易于结合各种蛋白因子，最终导致X染色体失活。

第21页：蛋白质磷酸化与基因表达

二、蛋白质磷酸化与基因表达

蛋白质的磷酸化反应

是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程，是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。

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第23页：蛋白激酶与蛋白磷酸酶的数量

已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。

蛋白质的磷酸化

由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程；其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。

第24页：磷酸化在细胞信号转导中的作用

1、蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用

• （1）在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如cAMP、Ca²⁺、DG（二酰甘油，diacylglycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。
• （2）蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。
• （3）对外界信号具有级联放大作用。
• （4）蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。

被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。

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第27页：信号转导示意页

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第28页：信号转导示意页（续）

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第31页：真核细胞主要跨膜信号转导途径

2、真核细胞主要跨膜信号转导途径：真核细胞通过多种跨膜受体系统将胞外信号传入胞内，引发级联的蛋白质磷酸化反应。

第32页：蛋白激酶的三类底物特异性

3、蛋白激酶的种类与功能：根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为三大类：

• 第一类为丝氨酸/苏氨酸型，这类蛋白激酶使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。
• 第二类为酪氨酸型，被磷酸化的是底物的酪氨酸残基。
• 第三类是“双重底物特异性蛋白激酶”（dual-specificity protein kinase），既可使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化又可使酪氨酸残基磷酸化。

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第34页：信使依赖与非信使依赖激酶

根据是否有调节物来分又可分成两大类：

• 信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protein kinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依赖性激酶两个亚类。
• 非信使依赖型蛋白激酶。

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第36页：受cAMP调控的A激酶

4、受cAMP调控的A激酶：被A激酶磷酸化的蛋白质其N端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特异氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改变了这一蛋白的酶活性。这一酶活性代表了绝大多数细胞中cAMP所引起的全部反应。

PKA全酶由4个亚基组成（R₂C₂），包括两个相同的调节亚基（R）和两个相同的催化亚基（C），全酶的分子量为150-170 kD。

第37页：A激酶活化糖原磷酸化酶的级联

• C亚基具有催化活性，R亚基具有调节功能，有两个cAMP结合位点。R亚基对C亚基具有抑制作用，所以R和C聚合后的全酶（R₂C₂）无催化活性。R亚基与cAMP的结合导致C亚基解离并表现出催化活性。
• 激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解并提供ATP。

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第41页：C激酶与PIP2、IP3和DAG

5、C激酶与PIP₂、IP₃和DAG：磷酸肌醇级联放大的细胞内信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP₂）的两个酶解产物：肌醇1，4，5-三磷酸（IP₃）和二酰基甘油（DAG）。C激酶（PKC）是依赖于Ca²⁺的蛋白质激酶。由于IP₃所引起的细胞质Ca²⁺浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠原生质膜内侧处，并被DAG和Ca²⁺的双重影响所激活。

C激酶的活性也受磷脂酰丝氨酸的影响，原因是后者大大提高了C激酶对于Ca²⁺的亲和力，从而使得C激酶能被生理水平的Ca²⁺离子所活化。C激酶主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，它具有一个催化结构域和一个调节结构域。

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第43页：CaM激酶及MAP激酶

6、CaM激酶及MAP激酶：Ca²⁺的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶（CaM-kinase）来实现，它们也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，但仅应答于细胞内Ca²⁺水平。

MAP激酶（mitogen-activated protein kinase，MAP-kinase，又称为extracellular-signal-regulated kinase，ERKS）活性受许多外源细胞生长、分化因子的诱导，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受体系统的调控。MAP-激酶的活性取决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是否都被磷酸化。科学家把能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶称为MAP-激酶-激酶，它的反应底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，从而在信息传导中发挥功能。

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第45页：酪氨酸蛋白激酶与生长因子受体

7、酪氨酸蛋白激酶：对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区。

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第47页：受体酪氨酸蛋白激酶RPTK的结构域

具有受体功能的酪氨酸蛋白激酶（receptor protein tyrosine kinase，RPTK）

包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合的结构基础。

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第49页：RPTK的跨膜区与胞内活性区

跨膜结构区

是连接受体细胞内、外两部分，镶嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是由碱性氨基酸形成簇状结构。

胞内活性区

保守性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸，可能是RPTK活性的功能的调节部位；第二部分为活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性，该区含有ATP结合位点和底物结合位点，可能是不同类型RPTK底物特异性的决定区域；第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具有高度的可塑性。

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第52页：Cyclin与CDK的活化循环

CDK活性随细胞周期的调控过程：

• 没有Cyclin，CDK无活性。
• Cyclin的合成和积累，形成Cyclin和CDK复合物。
• Tyr磷酸化阻碍了ATP的结合，CDK仍然无活性。
• T-环中的Thr被磷酸化，Tyr上的磷酸基团被去掉，CDK活性大为增强。
• CDK使磷酸酯酶磷酸化，进一步提高其活性。
• CDK使DBRP磷酸化，具有酶活性。
• 在DBRP的帮助下，泛素连接酶把泛素加到Cyclin上。
• Cyclin被降解，CDK失活。

见Lehninger, figure 13-33。

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第57页：CDK通过磷酸化控制细胞分裂

• CDK通过蛋白质磷酸化过程控制细胞分裂。没有被磷酸化的PRb能与转录因子E2F相结合并使后者不能激活一系列与DNA合成有关的酶，导致细胞无法由G1进入S。
• erbB原癌基因其实编码了一个突变的EGF受体蛋白，它的胞内激酶活性区被永久性激活（相当于EGF到正常EGF受体上）。因此，erbB导致了细胞的永久型分裂。

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第61页：丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶

8、蛋白磷酸酯酶：Ser/Thr蛋白磷酸酯酶主要包括PP-1、PP-2A、PP-2B和PP-2C四类。

• PP-1是糖代谢中的一个关键酶，具有很高的活性，其催化亚基为38 kDa，可以与其它组分或调节亚基组成全酶。
• PP-2A全酶包括一个36 kDa的催化亚基和一个65 kDa的调节亚基。
• PP-2B是目前所发现的唯一受Ca和CaM调节的蛋白磷酸酶，催化了磷酸化酶激酶α亚基的脱磷酸化作用，由61 kDa的A亚基和16 kDa的B亚基组成，A为催化亚基。
• PP-2C的分子量为43-48 kDa，其活性需要mmol/L水平的Mg²⁺，现对其参与调节的生理过程知之甚少。

第62页：酪氨酸蛋白磷酸酶PTP

酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP）

主要有胞内型与跨膜受体型两类。两类PTP的共同点是它们的催化域中氨基酸顺序极为相似，共有240个氨基酸，内含-HCXGXXR（S/T）G-的“signature motif”。胞内型PTP只有一个催化域；受体型中常有两个催化区，其不同类型的胞外结构往往不同。PTP1B（胞内型）是一个37 kDa的胞内酶，在氨基酸水平上与CD45（跨膜受体型）的胞内部分有很高的同源性。CD45是一类在结构上相关的高分子量（150-280 kD）跨膜蛋白，具有与受体极为相似的结构特点，在免疫T细胞和B细胞中含量极高。

第63页：转录因子核定位的调节

9、蛋白质磷酸化与基因表达：处于信号传递链终端的蛋白质磷酸化既能对许多酶蛋白及生理代谢过程起直接的调节作用，又能通过使转录因子磷酸化来调节基因活性。

a. 对转录因子核定位的调节：SV40抗原未磷酸化时存在于胞质，其111和112位残基被酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）磷酸化后，其分子内的核转位信号结构域（nuclear transport signal，NTS）变构而易于进入细胞核发挥作用。

第64页：转录因子核定位调节示意页

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第65页：SWI5、NF-κB等因子的核定位调控

转录因子SWI5只在G1期存在于细胞核内，激活核酸内切酶基因转录。在其它时期则以磷酸化的形式存在于细胞质中。CdC2使其核转位信号结构域附近的3个Ser残基磷酸化，使之无法进入核内，失去激活基因转录功能。

有时转录因子上存在一种抑制结构（R），掩盖了它的NTS功能区，从而不能进入核内；磷酸化使该区暴露，从而易于进入核内。有时，非磷酸化状态下转录因子与胞质锚定或抑制亚基结合，掩盖其NTS结构使之不能进入核内。当转录因子本身或者其抑制亚基被磷酸化，使NTS结构暴露，进入核内发挥功能。转录因子NF-κB常与IκB结合成复合体存在于胞质中，只有在被各种刺激因子或佛波脂（PKC激活剂）作用后IκB磷酸化并与NF-κB解离，后者才能进入核内。

第66页：转录因子核转位示意页

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第67页：转录因子DNA结合活性的调节

b. 对转录因子DNA结合活性的调节：转录因子上的DNA结合结构域（DBD）或其附近残基被磷酸化后，由于负电荷增加而减弱了转录因子DBD和DNA序列的静电相互作用。

• 静止态细胞中，AP-1复合体中转录因子c-Jun DBD附近的3个氨基酸残基（Thr231、Ser243和Ser249）被Gsk-3和CKⅡ磷酸化，不能与DNA结合。受到生长因子等刺激时，c-Jun脱磷酸，恢复DNA结合活性并激活基因转录。
• 血清反应因子（SRF）DBD区上游附近有4个磷酸化位点（577/579/583/585），未磷酸化时无DNA结合活性；受到刺激时4个残基全被磷酸化，有较强的DNA结合活性。

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第71页：基因重排与抗体多样性的提出

三、基因重排的分子机制

• 早在50年代，人们就认识到抗体分子的每一条链都是由高度多变的V区和相对不变的C区组成的，V区赋予抗体分子对抗原的特异性。
• 抗体分子V区的多样性和C区的稳定性显然是矛盾的。Dreyer和Bennett于1965年首次提出假设，认为每条抗体链实际上至少由两个基因所编码，其中一个是恒定的，一个是可变的。
• 1983年，Tonegawa（Nature, 302:575-581）在对产生抗体的骨髓瘤及浆细胞瘤进行研究时发现，产生抗体的细胞中Ig基因结构与其它不合成抗体分子的细胞中的结构不一样。

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第73页：免疫球蛋白的分子组成

• 在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链（λ和κ链）基因座都由多个编码V区和C区蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA所分隔。
• 抗体分子由4条（两对）多肽链组成，包括两条相同的轻链（L-chain）和两条相同的重链（H-chain）。轻链和重链在相对分子质量上有较大差别，前者约2.3×10⁴，后者则介于5.3×10⁴-7.0×10⁴之间。
• 所有Ig分子都含有两类轻链中的一类，即κ型或λ型。κ型和λ型轻链的恒定区和可变区的氨基酸序列是不同的。在小鼠中，95%的抗体轻链是κ型，而人类抗体轻链中κ型和λ型各占50%左右。

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