08 原核生物基因表达调控.ppt

第1页：8 原核生物基因表达的调控8.1

8 原核生物基因表达的调控8.1 乳糖操纵元lactose operon8.2 色氨酸操纵元8.3 基因转录的时序调控8.4 小分子RNA的翻译调节

第2页：1 Discovery of

1 Discovery of

• 1961年, F. Jacob & J.Monod提出, 此后不断完善。
• 获1965年诺贝尔生理学和医学奖
• 1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；
• 在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。
• 即产生“二次生长曲线”。
• 文献：细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶
• 1947年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”Francis JacobJacques Monod8.1 乳糖操纵元

第3页：Z基因

Z基因

与合成β-半乳糖苷酶有关；

I基因

决定细胞对诱导物的反应。

Szilard

I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。

Jacob

结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。

第4页：乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß

乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß-半乳糖苷酶操作位点乳糖操纵元结构调节基因

第5页：操纵元是一种完整的具有特定功能的细菌基因

操纵元是一种完整的具有特定功能的细菌基因

• 结构基因：产生mRNA,合成蛋白质
• 操纵位点promotor,operator：启动子结合位点
• 调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）→结构基因不转录诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合→结构基因转录Control elementStructural genes

第6页：2 酶的诱导现象B-半乳糖苷酶

8.1.2 酶的诱导现象B-半乳糖苷酶

第7页：分解底物的酶只有在底物存在时才出现

分解底物的酶只有在底物存在时才出现

• 无乳糖时，几个B-gal/cell加入乳糖时，5000个再去掉乳糖，lac mRNA下降乳糖能激发lac mRNA的合成
• 乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？
• 培养基（35S-aa, 无乳糖）→ E.coli繁殖→培养基（无35S -aa, 加入乳糖）→ β-gal(无35S)

第8页：3 调控机理1 调控区结构

3 调控机理1 调控区结构

• lacI, 1045bp，独立Pi
• P, 82bp，－82～＋1
• O, 35bp，－7～＋28lacZYA

第9页：体外结合竞争实验

体外结合竞争实验:阻遏物＋RNA pol, offRNA pol＋阻遏物，on2.阻遏状态

第10页：3 诱导状态诱导物诱导作用

3 诱导状态诱导物诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性

第11页：4 诱导物不是乳糖生成lac诱导物乳糖代

4 诱导物不是乳糖生成lac诱导物乳糖代谢Allolctose 异构乳糖别乳糖细胞内β-半乳糖苷酶来源?

第12页：gratuitous inducer

gratuitous inducer

• 可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物
• IPTG，异丙基半乳糖苷
• TMG ，巯甲基半乳糖苷
• ONPG, O-硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖

第13页：4 阻遏蛋白的作用机制1 阻遏蛋白结构

4 阻遏蛋白的作用机制1 阻遏蛋白结构

• 38KD，4 聚体，一个亚基结合一个IPTG分子
• lacI组成型转录Pi 弱启动子，5－10个／cell
• 具有二重性阻止转录（与lacO结合）开始转录（与诱导物结合）

第14页：阻遏蛋白的结构域头段

阻遏蛋白的结构域头段，-NH2端，lacO结合区绞链区核心段，-COOH，诱导物结合区

第15页：4个亚基的核心片段接触形成四聚体

4个亚基的核心片段接触形成四聚体

第16页：

第17页：对称轴

对称轴，+11 对称序列，6bp2.阻遏蛋白的结合位点－－lacO的结构

第18页：3阻遏蛋白对RNA pol功能的影响

3阻遏蛋白对RNA pol功能的影响

• 阻遏蛋白和RNA pol可同时与DNA结合RNA pol 与启动子结合的平衡常数1.9X107有阻遏蛋白时, 2.5X109
• 结合着的RNA pol不能转录. 但加入诱导物后, 释放出阻遏蛋白, 变为开放型启动子复合物.
• 阻遏蛋白实际上使RNA pol贮存在启动子上。
• 这一模式是否存在于其它操纵元系统中？

第19页：+ glucose-glucoseTime

+ glucose-glucoseTime

• 葡萄糖抑制lac mRNA的转录：可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与

第20页：葡萄糖对lac操纵元表达的抑制是间接的

葡萄糖对lac操纵元表达的抑制是间接的

• 葡萄糖的降解是通过cAMP与CAP结合起作用的cAMP:环化腺苷酸CAP, catabolite activator protein由crp编码CRP, catabolite receptor protein

第21页：

第22页：2 CAP结合位点

2 CAP结合位点

• CAP为二聚体，45KD ，被cAMP激活
• 结合位点～22bp I -70 ~ -50II -50 ~ -40

第23页：由于序列的差异

由于序列的差异，使不同基因受cAMP激活的水平不同结合位点序列保守

第24页：3 CAP的结合对DNA构型的影响DNA

3 CAP的结合对DNA构型的影响DNA

• 弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心
• 弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触

第25页：1CAP结合位点与转录起始点的位置

1CAP结合位点与转录起始点的位置

• （1）CAP结合位点与转录起始点的位置
• CAP与转录起始点的距离，相距数个整双螺旋
• CAP结合位点在启动子的上下游，都能发挥作用4CAP对转录的影响

第26页：2基因转录对cAMP—CAP系统的依

（2）基因转录对cAMP—CAP系统的依赖性，与启动子本身的效率有关cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降低，促进开放型启动子复合物的形成

第27页：3CAP激活转录的方式

3CAP激活转录的方式

• （3）CAP激活转录的方式
• CAP直接作用于RNA pol a亚基缺失RNA pol a亚基的—C末端时，失去受CAP激活的能力
• 作用于DNA，改变其结构

第28页：6 lac operon

6 lac operon

• 阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；
• 如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性
• CAP组成型合成，所以cAMP－CAP复合物取决于cAMP含量
• 腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此cAMP－CAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶
• 降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵元就不表达

第29页：A基因及其生理功能编码B

A基因及其生理功能编码B

• 该酶不参与乳糖代谢！
• 生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。
• 半乳糖苷乙酰化后，即无毒. 所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3. lac基因产物数量，1：0.5：0.2不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节. 方式有二:核糖体脱离: 多顺反子的差别性翻译内切酶作用: 在lac mRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用

第30页：Summary

Summary

第31页：

第32页：Summary of lac operon

Summary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthigh rate of expression

第33页：2 Trp operon生物细胞中的氨基

2 Trp operon生物细胞中的氨基

• 细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。

第34页：trpR

trpR

• trpR, 阻遏蛋白
• P，-40~+18
• O, -21~+1
• L, +1~+162
• 结构基因t, A下游36bp, 不依赖pt’, t下游250bp，依赖p8.2.1 基因组成

第35页：sne298

sne298

第36页：2 Trp operon 的阻遏系统1

8.2.2 Trp operon 的阻遏系统1 Trp R 四聚体

第37页：阻遏蛋白＋trp→有活性的阻遏物

阻遏蛋白＋trp→有活性的阻遏物

• SNE299＋trp O →不转录

第38页：2 阻遏蛋白的结合位点

2 阻遏蛋白的结合位点

• trpO -21 ~ +1，反向重复序列
• trpP -40 ~ +18
• 活性阻遏物与trpO 的结合与RNA pol与启动子的结合发生竞争SNE299

第39页：3阻遏系统

3阻遏系统

• 主管转录是否启动，
• 在缺乏Trp时，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录粗调开关

第40页：

第41页：弱化子

弱化子，衰减子，α

第42页：序列分析发现

序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构Terminator

第43页：S312POE4321LDNARNAATGTGA2

S312POE4321LDNARNAATGTGA2 trp codons14322前导肽14aa

第44页：

第45页：3转录弱化作用Lack of trp

3转录弱化作用Lack of trp Lack of aminoacyl tRNA Ribosome pause at trp codons , occluding sequence 1Form 2:3 hairpinanti-terminatorTranscription into trpE and beyond

第46页：High trp Trp is inserted at

High trp Trp is inserted at the trp codons Translate to the end of leader message Ribosome occlude sequence 2Terminate transcription at (3:4 form terminator)

第47页：弱化子对转录调控的关键

弱化子对转录调控的关键

• 空间结构，10th and 11th codons encode trp residues (rare AA)
• 时间，核糖体停顿在2个Trp 密码子上时，产生延宕，此时4区未转录出来The leader peptide is to determiner trp availabilityand to regulate transcription termination14–amino-acid (encoded by27-68of theleader RNAsummary

第48页：4 阻遏作用与弱化作用的协调

4 阻遏作用与弱化作用的协调

• 阻遏效率启动子的转录起始频率在R+和R-相差70倍
• 弱化作用trp存在时，约有10％的RNA pol侥幸转录-trp
• 活性阻遏物－－－－→无活性阻遏物←－－－－+trptrp操纵子具有双重调节体系？

第49页：Negative—repressible

Negative—repressible

• 当大量Trp 存在时，阻遏系统起作用。
• 阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。经济

第50页：仅有少量trp时

仅有少量trp时

• 当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp 合成。
• 因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。

第51页：5 细菌演化出弱化系统的生物学意义

5 细菌演化出弱化系统的生物学意义

• 通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏
• 氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA 荷载为标准进行调控更为恰当
• 两个调控系统，避免浪费提高效率阻遏系统高水平trp时，不转录低水平trp时，转录至LS弱化系统细调原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性

第52页：

第53页：6 正控制系统和负控制系统1

6 正控制系统和负控制系统1

• 在没有调节蛋白质存在时基因表达，加入调节蛋白后基因表达活性被关闭
• 阻遏蛋白：负控制系统中的调节蛋白

第54页：Add signal mol. Operon

Add signal mol. Operon offCo-repressor 辅阻遏物Add signal mol. Operon onInducer 诱导物(inducibleoperon)(repressibleoperon)

第55页：2 正控制系统

2 正控制系统

• 2 正控制系统：
• 没有调节蛋白质存在时基因关闭,加入这种调节蛋白质后基因活性被开启诱导蛋白

第56页：3基因转录的时序调控

3基因转录的时序调控

• 概念：原核生物在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照一定时间顺序进行的
• 意义有效利用能源避免不适当的表达，造成的危害
• 途径σ亚基的更换（枯草杆菌，E.coli，T4 phage）T7噬菌体生长过程中RNA pol的替代λ噬菌体基因表达的调控

第57页：σ亚基的更换8.3.1枯草杆菌噬菌体SP

σ亚基的更换8.3.1枯草杆菌噬菌体SP

• SPO1，烈性噬菌体
• 如何实现早中晚基因表达的转换?
• 通过更换σ亚基，使SPO1的早中晚基因有条不紊地表达σ因子的负责识别启动子的保守序列，是转录起始唯一需要的因子。
• 许多细菌能生产多种可取代的σ因子，以识别不同的启动子。
• 当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的σ因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合

第58页：早期，α2ββ‘σ55

早期，α2ββ‘σ55，产生gp28gp28取代σ55

第59页：中期，gp28取代σ55产生gp33

中期，gp28取代σ55产生gp33, gp34

第60页：晚期,gp33,gp34取代gp28

晚期,gp33,gp34取代gp28，σ55

第61页：枯草杆菌中每个σ因子都能识别具有特征性

枯草杆菌中每个σ因子都能识别具有特征性

第62页：2 E.coli热休克基因的表达

2 E.coli热休克基因的表达

• 热激反应（热休克，热震惊）
• 正常情况下，σ70高温下，σ32，32 kD rpoH识别热休克基因的启动子σ70S304

第63页：不同热休克基因识别的启动子序列不同

不同热休克基因识别的启动子序列不同

第64页：Q: σ70，热激反应中不需要

Q: σ70，热激反应中不需要

• 从E.coli到人类，都有热休克基因
• 不同种属中，热激蛋白的氨基酸序列高度相关A: σ70中含有Phs (热休克启动子), 能在高温下表达为恢复正常秩序作准备.Phsσ70大多数热休克基因，在细菌适应较高温度后，停止表达。
• 如大肠杆菌，42度20分钟后,开始表达常规基因

第65页：4 小分子RNA的翻译调节8.4.1

4 小分子RNA的翻译调节8.4.1

• 1983年，Mizuno, Simon几乎同时发现RNA可作为调节因子，与调节蛋白一样，RNA合成后，可扩散到靶位点。
• RNA也可作为调节物质？！
• 反义RNA，可与mRNA结合结合位点是S-D, AUG, 部分N端密码子与RNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物与转录产物结合，使转录提前终止

第66页：例，E coli 中外膜蛋白ompF

例，E coli 中外膜蛋白ompF 的表达调控λ噬菌体，cII蛋白抑制晚期基因转录Tn10中转座酶翻译的调节

第67页：2 E coli中ompF基因的翻译调节

8.4.2 E coli中ompF基因的翻译调节Env，编码渗透压感受器的受体蛋白ompC低渗时，ompC关闭，ompF增加高渗时，ompC增加，ompF下降ompC与ompF是外膜蛋白，受培养基渗透压的调节

第68页：

第69页：RNAi 技术

RNAi 技术

• 1998年2月，Andrew Fire等将单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。
• 将这一现象称为RNA干扰
• 1984年，抗病毒药物的开发
• 1988年, 转基因番茄（PG 酶的反义RNA）

第70页：延缓成熟的转基因西红柿

延缓成熟的转基因西红柿

• ACC，1-氨基丙环烷羧酸氧化酶，乙烯合成途径酶类
• PG，半乳糖醛酸酶
• 第一个上市的转基因植物

第71页：思考题1概念

思考题1概念：操纵元、诱导物、阻遏物、降解物敏感型操纵元、弱化子、正控制、负控制、RNAi2请说明乳糖和色氨酸操纵元的调节机制3葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用哪一种糖，为什么？