页数：187页文件大小：7.93 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件围绕RNA转录展开，先介绍转录的基本概念与RNA聚合酶，再分别解析原核与真核生物转录起始的启动子结构与调控因子，讲解延伸与终止方式，最后说明转录产物的加帽、加尾、甲基化与内含子剪接。
第六章RNA转录(RNA transcription)
6.1. 基本概念6.2. 原核生物RNA转录的起始6.3. 真核生物RNA转录的起始6.4. 转录的延伸6.5. 转录的终止6.6. 原核生物转录产物的后加工6.7. 真核生物转录产物的后加工6.8. 真核生物转录产物中内元的去除6.9.不连续转录和反式拼接
第一节基本概念
转录(transcription)
有义链(sense strand)
τ在依赖DNA的RNA聚合酶作用下进行转
τRNA 的转录包括promotion. elongation. terminaton 三过程τ从启动子(promoter)到终止子(terminator)称为转录单位(transcription unit) (转录起始点)τ原核生物的转录单位多为polycistron in operon,真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon τ转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游记为正值upstream start point downstream－10＋1＋10
第二节原核生物RNA转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots)
两个相关概念:＊操纵元(operon):是原核生物基因表达调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子ipozyaNo lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozyaβ-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresence of lactoseInactive
启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点(频率、效率) 一、原核生物的RNA polymerase (E. coli)1、全酶(Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme)＋σββ’ααCore Enzymeβααβ’σHolo Enzyme
1 全酶（Holo Enzyme）
2）核心酶（Core Enzyme）
此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚
不同的σ因子识别不同的启动子E.coli
3β因子
E site
由于各亚基的功能
E. coliRNA polymerase用于起始和延伸只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD
二、启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）1、启动子由两个部分组成（1）上游部分—CAP-cAMP结合位点（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白（2）下游部分—RNApol的进入（结合）位点－35 ~ －10包括识别位点和结合位点（R B位点）
RNA聚合酶的进入位点
2Pribonow 框
（3）起始位点（initiation site）：＋1位点RNA聚合酶的转录起始位点起始NTP多为ATP或GTP
起始过程：a. 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成（R位点被σ因子发现并结合）
开放型启动子复合物的形成
12～17bp
c. 在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（β亚基）三元复合物形成+1位多为CAT模式,位于离开保守T 6~9 个核苷酸处---6-9 bp---GC TATTGACATATAAT-----16-18 bp-------+1-35 sequence-10 sequence（4）σ因子解离→核心酶与DNA的亲和力下降起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程
转录的起始过程σ核心酶12～17bp
（β亚基）
3、CAP-cAMP 结合位点（也称CAP位点）转录调控中，I → 阻遏蛋白→ 负调控lac操纵子模型
I
许多基因的表达还存在正调控机制例如
因此,一个操纵元中有两道控制开关
2位点Ⅱ结合CAP
上节课内容回顾:1、原核生物RNApol：2、原核启动子的结构：RNApol进入位点起始过程上游位点的组成和功能
RNApol
限制酶切分离大片段DNA
末端标记大分子DNA重新结合RNApol作对照直接用DNase 进行降解电泳用微量DNase降解电泳
用足迹法鉴定出来的RNApol
则不同的启动子a.
2－35序列与
E.Coli各σ识别的启动子的序列
第三节真核生物RNA转录的启动RNA Transcription promotion in Eukaryots
一、真核生物的RNApol1、三种RNApol：根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类RNApolⅠ最不敏感（动、植、昆）RNApol Ⅱ最敏感RNApol Ⅲ不同种类的敏感性不同2、位置和转录产物RNApolⅠ核仁活性所占比例最大转录rRNA（5.8S、18S、28S）
RNApolⅡ核质主要负责hnRNA
亚基组成
CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化磷
RNApolⅡ的启动子结构最复杂
定位转录起始点的功能
4）增强子（enhancer）
♪距离效应
6其他元件
不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不
2、RNApol Ⅲ启动子结构（1）分为三类，每种识别方式不同a、下游启动子（内部启动子）位于转录起始点的下游5SRNA 和tRNA基因可分为两类b、上游启动子snRNA
2内部启动子的发现最早发现于非洲爪蟾
5S rRNA基因的启动子位于基因内部
上节课内容回顾:1、RNApol在DNA上结合位点的鉴定2、启动子的各部位与转录效率的关系3、真核生物RNApol：种类及各自转录的基因亚基组成4、RNApolⅡ的启动子5、RNApolⅢ的启动子
三、真核生物转录的起始♫三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力♫转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定位于转录起始点
RNApol ⅠTBP因子
RNApol Ⅱ
RNApol Ⅲ的转录起始◎两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子TFⅢA 一种含锌指结构的蛋白TFⅢB 由TBP和BRT、B”TFⅢC 至少5个亚基以上
TBP 的作用
第四节转录延伸Transcription Elongation
起始到延伸的转变
延伸过程（Prok）
转录泡
拓扑学问题ΦRNA合成过程中
旋转酶
3、转录过程中的延宕（1）RNA的合成速度大约30 ~ 50 个核苷酸／秒,与蛋白质的合成速度相近（15个AA／sec）（2）模板DNA中G／C 的存在延宕（G／C后的8~10 个核苷酸）延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用思考:延宕发生的原因?
第五节转录的终止Transcription termination
终止过程
一、原核生物的终止子1、终止子的种类（1）内在终止子（不依赖ρ因子的终止子）体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止（2）依赖ρ因子的终止子蛋白质辅助因子－－ρ因子存在时，核心酶终止转录两者有共同的结构特征（序列差异）
不依赖ρ因子的终止子结构特征
不依赖ρ终止子结构IRIR茎部富含GC
3、依赖ρ因子的终止子（1）结构IR序列中的G／C对含量较少发夹结构末端没有固定特征（2）靠与ρ的共同作用而实现终止
无连续U串G/C含量较少
二、原核生物转录的终止1、不依赖ρ因子的终止子终止转录（1）新生RNA链发夹结构形成与RNApol发生作用造成高度延宕（典型的有60秒左右）（2）RNApol暂停为终止提供了机会，6 ~8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号RNA－DNA之间的rU－dA 结合力较弱阻止RNA链的释放
于是：RNA－DNA解离三元复合体解体RNApol解离转录终止（3）真正的终止点不固定，在U串中的任何一处（4）IR序列和U串同等重要IR中的G／C对含量的减少U串的缩短或缺失（5）DNA上与U串对应的为富含A／T的区域说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用
2、依赖ρ因子的终止子终止转录（1）通读（read through）：在依赖ρ因子的转录终止过程中，RNApol 转录了IR 序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有ρ因子存在，则RNApol 会继续转录（2）ρ因子a、活性形式为六聚体促进转录终止的活性，NTPase 活性
b、RNA长度大于50nt时，依赖RNA的NTPase活性最大说明：ρ因子识别和结合的是RNA（3）ρ因子对终止子的作用a、ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’端）b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动（NTP水解供能）（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会）c、ρ因子与RNApol 相互作用而造成转录的终止
ρ结合上来追赶RNApolρ追赶上来（暂停）ρ与RNApol相互作用使杂交链解链终止子
（4）终止反应还需要RNA 与DNA 的相互作用即：需要一定的RNA序列因为：其与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合ρ因子与RNApol 的作用（发夹结构下游的AU序列）序列不同的终止子→→不同的终止程度→→基因表达调控的途径之一
5Prok.依赖ρ因子的终止子为基因
RNApol核糖体ρ因子无义突变位点
三、终止与抗终止及抗终止因子♦各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段的基因表达*枯草杆菌------更替σ因子* T7噬菌体------更换RNApol* λ噬菌体采用依赖于ρ因子的终止以及通过抗终止因子的抗终止作用
λPhage的操纵元组织情况PMPLPRPR’重组复制裂解溶原周期溶菌周期
PNPQ抗终止作用的过程早期迟早期晚期
♫抗终止的机制
上节课内容回顾:1、转录的延伸2、转录的终止不依赖ρ因子的终止子终止转录依赖ρ因子的终止子终止转录3、抗终止
真核生物的终止子及转录终止了解很少
第六节原核生物转录产物的后加工Pre-RNA processing in Prokaryotes
ΦProk.的mRNA半衰期只有几分钟
rRNA 后加工1
三个rRNA基因的相对位置有一定规律…16S rDNA……间隔tDNA…….23S rDNA…….5S rDNA……收尾tDNA…加工过程主要是RNAseⅢ等酶的作用
双链区域
二、tRNA的转录后加工1、tRNA 基因（1）转录单元大多是多基因的同一个tRNA基因、不同tRNA基因、与rRNA基因（2）有两种类型的tRNA 基因：Ⅰ型具有3’端的CCA序列Ⅱ型没有3’端的CCA序列
（3）Ⅰ型需在酶的作用下切除CCA下游一段序列（Prok. 的tRNA多为Ⅰ型）Ⅱ型需要在酶的作用下添加CCA序列（少数Phage 、Euk.）
2、参与tRNA后加工的酶（1）RNAaseP：内切核酸酶，核蛋白使tRNA产生成熟的5’端识别tRNA的空间构象（2）RNAaseD：外切核酸酶，使Ⅰ型tRNA暴露出CCA端a、RNAaseP 存在时RNAaseD可达最大活性b、RNAaseQ、RNAaseY、RNAaseP3与此酶功能相同
（3）tRNA核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）以ATP和CTP为前体，催化tRNA（Ⅱ型）的3’端生成CCAa、E.coli中该酶基因突变后，会影响菌株生长（CCA末端常丢失）b、识别tRNA的空间结构，无种属特异性（4）RNAaseⅢ：与RNAaseO、RNAaseP2的功能相似，负责切开间隔序列
3、E.coli 的tRNATyr1分子的修饰过程编码基因的原始转录物三磷酸有两个基因拷贝间隔子（各长350base）
有一个tRNATyr1的转录单元的原始转录物的修饰过程①②③④⑤⑤⑤⑤
RNA中的甲基化及常见的修饰核苷酸m5C
常见tRNA中的修饰核苷酸Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U（5-甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U（5-甲基-2硫代尿苷）K2C（2-赖氨酸胞苷）Com5U（5(2)-羟羧甲基尿苷）I（Inosine次黄嘌呤）m7G(7-甲基尿苷)m5C（5-甲基胞苷）m6A （6-甲基腺苷）s2C（2-硫代胞苷）ψ (假尿苷）Um(2’-O-甲基尿苷)Q （Queuosine）Xo5U(5-羟基尿苷)OHOHNHCH2H2NR
第七节Euk转录产物的后加工Pre-RNA processing in Eukaryotes
一、rRNA的转录后加工主体rRNA基因（5.8S、18S、28SrDNA）组成一个转录单元47S前体45S前体a、甲基化位点可能是酶识别的标志b、加工的对象是一种核蛋白c、哺乳动物的45SRNA前体有几种不同的加工方式
二者的共同之处
二、mRNA的转录后修饰－--------帽子1、帽子的种类帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp----------（共有）m7G N7—甲基鸟苷帽子1 （Cap-1）m7GpppXmpYp----------第一个核苷酸的2’-O 位上产生甲基化（A N6 位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp第二个核苷酸的2’-O 位上产生甲基化（A、G、C、U）
HN—CH3m7G帽子0
单细胞真核生物只有Cap—0
3、帽子结构的功能（1）对翻译起识别作用------为核糖体识别RNA提供信号Cap—0 的全部都是识别的重要信号Cap—1,2 的甲基化能增进识别（2）增加mRNA 的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击（3）与某些RNA病毒的正链合成有关（Cap—1、Cap—2 ）除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－m6A形式
三、mRNA的转录后修饰二--------多聚（A）尾巴1、3’端-----约长200bp (大多数Euk.的mRNA) （poly(A)+poly(A)-）最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有3’添加poly(A) 的现象E.coli 的poly(A)+聚合酶早在1962年就已发现2、poly(A) 的生成a、RNA末端腺苷酸转移酶（poly(A) 聚合酶）催化前体－－ATP
反应如下：多聚核糖核酸+ nATPMg++ 或Mn++多聚核糖核酸(A)n + nPPib、添加位点内切酶(360KDa)切除一段序列由poly(A) 聚合酶催化添加poly(A)内切酶的识别位点（有其它因子参与）切点上游13－20bp处的AAUAAA切点下游的GUGUGUG （单细胞Euk.除外）
上节课内容回顾:1、Prok.转录产物的后加工rRNA tRNA2、Euk.转录产物的后加工尾巴的生成主体rRNA帽子结构
3、poly(A) 的功能c、对含poly(A) 的mRNA 失去poly(A) 可减弱其翻译（1）可能与核质转运有关）（2）与mRNA的寿命有关（3）与翻译有关a、缺失可抑制体外翻译的起始b、胚胎发育中，poly(A) 对其mRNA的翻译有影响（非poly(A) 化的为储藏形式）
（4）poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值a、也可将oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNAb、用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成cDNA
第八节Euk.转录产物中内元的去除Intron removing in Eukaryote
一、概述1、概念割裂基因（split gene）：指编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔开内元（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的DNA序列外元（excon）：
RNA拼接（RNA splicing）：一个基因的外元和内元共同转录在一条转录产物中，将内元去除而把外元连接起来形成成熟RNA分子的过程拼接点：5’ 拼接点或左拼接点（内元上游）3’ 拼接点或右拼接点（……下游）
2、内元的分类1982 Davies等人中部核心结构（central core structure）:在有些内元中，含有4个重复的保守序列，长度为10 ~ 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类
Ⅰ类内元（group Ⅰ）
四种内元的边界序列各有一定共同的特征
3、拼接方式方式一：由拼接装置完成（核mRNA内元）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二：自我拼接（两类内元Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应
二、tRNA的拼接（酵母为例）1、链的断裂和连接是两个独立的过程2、tRNA的内元均位于反密码环的3’端，与反密码子相距一个Nt（40／400）长14~16bp，其中含一段与反密码环互补的序列反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象3、拼接酶系识别的是二级结构
酵母tRNAphe
4、拼接过程研究方法构建温度敏感突变体（高温时……………..）分离累积tRNA前体体外加入野生型细胞抽提液研究拼接过程第一步：内切酶作用释放一条线状内元分子和两个“tRNA半分子”两个tRNA半分子采取成熟tRNA分子的构象(切刻)
第二步：RNA连接酶连接断端其中内切酶作用后产生5’OH 和3’磷酸，3’磷酸端很快转变为2’，3’环式核苷酸因此，一个半分子有两个磷酸末端，一个半分子有两个－OH末端
连接反应前要进行两个反应：a、左外元的3’端成为OH（环式磷酸二酯酶）其3’ 位为OH，2’ 位为磷酸b、第二个外元的5’端转变为磷酸基（多聚核苷酸激酶）因此Φ连接后还要切除第一个外元的2’—磷酸这是tRNA内元拼接重要特点之一
前体RNA两个半分子进行两个连接反应成熟tRNA
三、第Ⅰ类内元的拼接特点：ø拼接属于自我拼接ø形成明显的二级结构1、结构特点：（1）5’拼接点和3’拼接点-------U↓… …G ↓↓ ↓5’ ……exon……U……intron……G……exon……3’
（2）有由保守序列形成的二级结构a、保守序列为5’ －P－Q－R－S－3’距拼接点很远，各10~12bpP与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构
b、二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成的二级结构内部引导序列（interal guide sequence IGS）：内元中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列#第一类内元的拼接依赖于以上二级结构－－为自我拼接的进行提供活性位点
2、拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA 有内元5’ U G 3’小rRNA 大rRNA（26S 有内元）（2）35SRNA体外有自我拼接的能力反应需要：一价和二价离子鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和鸟嘌呤核苷）不需能量的供给（3）拼接反应后，G与内元（414base）5’端以磷酸二酯键相连（放射性标记试验）
（4）具体的拼接过程第一步：游离G发动的转酯反应G 的3’-OH 攻击内元的5’拼接点G-内元、左外元（有游离3’OH）
第二步：游离外元（左）发动的转酯反应左外元的3’-OH 攻击3’拼接点，同时释放线状的内元,形成成熟RNA分子
两次转酯反应是紧密偶联的
5自我拼接过程主要由转酯反应构成
科罗拉多大学Cech等人完成（美）活性位点
上节课内容回顾:1、pol(A)的生物学功能2、Euk.转录产物内元的去除tRNA内元的拼接内元的分类拼接方式的种类第类内元的拼接：结构特点、拼接机制
3、内元的催化功能35SRNA前体拼接释放的内元（414base）进行的自身转酯反应（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化
A 16（线性片段）U20(线性片段)逆环化逆环化
（2）C—15:逆环化将UUU加到5’端的能力表明: 该环形产物具有连接两个RNA分子的能力（3）L—19：具有酶活性即Cech等人证明的L—19 的polyC 聚合酶活性
L—19 分子
L—19 分子
（4）总结：a、四膜虫的35SRNA 的内元有自身催化的性质即---将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷酸二酯键，不需要额外的能量因此：内元可以看作是RNA重排酶（RNA rearrangease）或RNA异构酶（RNA isomerase）其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后变成了不同的分子
b、L—19的polyC 聚合酶活性进一步表明L—19 具有酶的主要特征：专一性强加快反应速度反应前后酶分子保持不变人们称这种由RNA构成的酶为----核糖核酸酯酶（ribozyme）可简称R酶
第二类内元的拼接1
在Branch Site 的两侧存在一些短的序列，与其上游10-50Nt处互成IR,形成茎环结构(但A不包含在IR序列内, 从而被排除成芽状突起）5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’IntronIR IR5’G AU3’A
2、拼接机制（Splicing mechanism）Int ronIR IRA5’G AU3’Exon 1 Exon2GAintronPyAUMatural RNA “Lariat”intron 套索状内元转酯攻击位点intronOH AU2‘A3‘G
五、核基因mRNA内元的拼接1、相关概念Euk.的细胞中，有许多碱基数在100 ~ 300之间的小分子RNA,每个细胞有105~106个snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）2、核mRNA内元拼接的结构特点内元拼接与其他加工同时进行
拼接点序列Breathnach
拼接机制
第一次转酯－－左外元
第九节不连续转录和反式拼接Discontinuous—transcription and Trans-splicing
顺式拼接：通过拼接将一个RNA分子的内元拼接掉，使外元连接在一起（cis-splicing）反式拼接：发生在两个RNA分子之间的拼接（trans-spling）一、不连续转录的发现1982 Vander Ploeg等人研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时发现在其mRNA的5’端有35个bases 是其基因中所没有的锥虫的全部mRNA都含有这个35bases 序列称其为前导序列（leader sequence）
前导序列
♫每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的5’拼接点GU♫而完整mRNA 的特异基因编码的mRNA 序列的前面都有一个保守的3’拼接点AG,以及分支点A
二、反式拼接前导序列与特异基因编码的mRNA 序列部分形成成熟的mRNA 的拼接方式属反式拼接1986 W. J. Marphy 和R. E. Sutton 1、前导序列的3’ 区和mRNA的5’区各相当于一个内元的一半2、拼接过程形成Y型结构线虫的肌动蛋白基因、植物叶绿体基因
本章内容结束
名词解释转录启动子RNA拼接左
简述内元的种类及拼接方式8
综合比较四种内元拼接方式的异同
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