第1页：第七讲真核基因表达调控封面
第七讲 真核基因表达调控
第2页：真核与原核调控的基本特征
- 真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。
- 原核生物的调控系统就是要在一个特定的环境中为细胞创造高速生长的条件，或使细胞在受到损伤时尽快得到修复，所以原核生物基因表达的开关经常是通过控制转录的起始来调节的。
第3页：真核基因调控的两大类与四个水平
真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：
- 第一类是瞬时调控或称可逆性调控，相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。
- 第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。
调控层次包括：转录水平调控（transcriptional regulation）、转录后水平调控（post transcriptional regulation）、翻译水平调控（translational regulation）、蛋白质加工水平的调控（regulation of protein maturation）等。
第4页：基因调控应回答的三个问题
研究基因调控主要应回答3个问题：
- ①什么是诱发基因转录的信号？
- ②基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？
- ③不同水平基因调控的分子机制是什么？
第5页：真核基因组的一般构造特点（上）
一、真核基因组的一般构造特点
- ①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。
- ②真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。
- ③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。
- ④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。
第6页：真核基因组的一般构造特点（下）
- ⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5'上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合。
- ⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。
- ⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。
第7页：真核基因的启动子
二、真核基因的启动子
- 启动子
- 是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。
不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子（trans-acting factors）也不同，因此基因转录活性也很不相同。
第8页：典型原核启动子的四大要素
Ⅰ.典型的原核启动子有四大要素：转录起始位点，-10区，-35区和-10区与-35区之间的间隔。
- 原核基因转录起始位点通常是嘌呤，其序列为CAT（A为起始位点）。
- -10区是一个6碱基保守序列（常以-10为中心）：T80A95t45A60A50T96，有助于DNA的解链。
- -35区是另一个6碱基保守序列（常以-35为中心）：T82T84G78A65C54a45。
- 研究表明，当-10区和-35区中心位置相距16-18bp时该启动子的功能较强；相距较近或较远时起始转录的功能都相应减弱。
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第11页：真核基因的三类启动子
Ⅱ.真核基因启动子：真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子。
第12页：I类启动子：rRNA基因
由RNA聚合酶Ⅰ负责转录的rRNA基因，启动子（Ⅰ类）比较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。
- 第一部分是核心启动子（core promoter），由-45—+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。
- 另一部分由-170—-107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率。
第13页：III类启动子：内部启动子
由RNA聚合酶Ⅲ负责转录的是5S rRNA、tRNA和某些核内小分子RNA（snRNA），其启动子（Ⅲ类）组成较复杂，又可被分为三个亚类。两类5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子（internal promoter），位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游。
第14页：II类启动子：起始子与TATA盒
由RNA聚合酶Ⅱ负责转录的Ⅱ类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因。编码蛋白质的Ⅱ类基因启动子在结构上有共同的保守序列。转录起始位点没有广泛的序列同源性，但第一个碱基为腺嘌呤，而两侧是嘧啶碱基。这个区域被称为起始子（initiator，Inr），序列可表示为Py2CAPy5。Inr元件位于-3—+5。仅由Inr元件组成的启动子是可被RNA聚合酶Ⅱ识别的最简单启动子形式。
多数Ⅱ类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定。TATA盒存在于所有真核生物中，是一个保守的七碱基对。
第15页：无TATA盒启动子
也有一些Ⅱ类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。
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第18页：增强子的概念与性质（上）
三、增强子及其对转录的影响
- 增强子
- 能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列性质：
- 1、增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍！
- 2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3 kp，或在基因下游，均表现出增强效应。
第19页：增强子的性质（下）
- 3、大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的。
- 4、增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能。
- 5、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应。
- 6、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。
第20页：增强子的作用原理
增强子的作用原理是什么呢？
- 一种观点认为，增强子为转录因子提供进入启动子区的位点。
- 第二种认为，增强子能改变染色质的构象，因为增强子区域容易发生从B-DNA到Z-DNA的构象变化。
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第22页：增强子功能的可累加性
增强子的功能是可以累加的。SV40增强子序列可以被分为两半，每一半序列本身作为增强子功能很弱，但合在一起，即使其中间插入一些别的序列，仍然是一个有效的增强子。因此要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变。对SV40增强子而言，没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍。
第23页：顺式作用元件与转录复合体的组成
四、反式作用因子对转录的影响：真核生物启动子和增强子是由若干可以区分的DNA序列组成的，由于它们和特定的功能基因连锁在一起，因此称为顺式作用元件。真核生物转录调控大多是通过顺式作用元件和反式作用因子复杂的相互作用而实现的。一般认为，如果某个蛋白是体外转录系统中起始RNA合成所必需的，它就是转录复合体的一部分。根据各个蛋白质成分在转录中的作用，能将整个复合体分为3部分：
第24页：转录复合体的三个组成部分
- ①参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。
- ②与转录的起始或终止有关的辅助因子，也不具有基因特异性。
- ③与特异调控序列结合的转录因子。它们中有些被认为是转录复合体的一部分，因为所有或大部分基因的启动子区含有这一特异序列，如TATA区和TFIID；更多的则是基因或启动子特异性结合调控蛋白，它们是起始某个（类）基因转录所必需的。
第25页：DNA结合结构域：螺旋-转角-螺旋
1、DNA结合结构域基序
- a. Helix-turn-helix（螺旋-转角-螺旋）
- 是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA序列相识别的氨基酸。
第26页：DNA结合结构域：锌指
- b. Zinc finger（锌指）
- 长约30个aa，其中4个氨基酸（Cys或2个Cys、两个His）与一个Zinc原子相结合。与Zinc结合后锌指结构较稳定。
第27页：DNA结合结构域：同源域
- c. Homeodomain（同源域）
- 最早来自控制躯体发育的基因，长约60个氨基酸，其中的DNA结合区与helix-turn-helix motif相似，人们把该DNA序列称为homeobox。主要与DNA大沟相结合。
第28页：DNA结合结构域：亮氨酸拉链
- d. Leucine zippers（亮氨酸拉链）
- 是亲脂性（amphipathic）的α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔6个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成DNA结合区。
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第30页：DNA结合结构域：碱性螺旋-环-螺旋
- e. 碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）
- 该调控区长约50个aa残基，同时具有DNA结合和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性α-螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其DNA结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。
第31页：转录激活结构域与酸性α-螺旋
2、DNA结合蛋白主要转录激活结构域：转录激活结构域（transcription activation domains）一般由20-100个氨基酸残基组成。如GAL4分子中有2个这种结构域，分别位于多肽链的第147-196位和第768-881位；GCN4的转录激活结构域位于多肽链的第106-125位。
- a. 酸性α-螺旋（acidic α-helix）
- 该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性α-螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平，可能是通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。
第32页：谷氨酰胺丰富区与脯氨酸丰富区
- b. 谷氨酰胺丰富区（glutamine-rich domain）
- SP1的N末端含有2个主要的转录激活区，氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳动物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。
- c. 脯氨酸丰富区（proline-rich domain）
- CTF家族（包括CTF-1、CTF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基。
第33页：CAAT盒激活因子CTF与CP家族
3、与已知DNA序列相结合的反式作用因子
- a. CAAT盒激活因子CTF（CAAT box transcription factor）家族
- 是能识别CAAT盒的一组转录因子，由单个基因通过可变换的剪接而形成的一组mRNA产生，家族成员对各种CAAT盒有相同的亲和力。
另一组CAAT区结合蛋白被称为CP，它们是从人的HeLa细胞中得到的。CP1具有对α-球蛋白和腺病毒晚期基因启动子CAAT区的高亲和力，CP2具有对γ-血纤蛋白原基因启动子CAAT区的高亲和力，而CP3能与腺病毒DNA相结合。CP族蛋白主要以异源多聚体的形式存在。
第34页：其他CAAT区结合蛋白与球蛋白调控区
除了CTF和CP族蛋白能与CAAT区结合外，科学家还从小鼠肝细胞里发现两个CAAT区结合蛋白。CBP对序列GCAAT有较强的亲和力，而ACF则对卵清蛋白基因启动子区的CCAAT有高亲和力。因此在启动区发现某个保守序列，并不等于同一个蛋白因子参与了该基因的调控。
对9个哺乳动物类β-球蛋白基因和1个人α-球蛋白基因5'调控区的研究发现，几乎每个基因都具有CCAAT（-80位左右）区和TATA（-30左右）区。
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第36页：一般性启动子与TATA区结合蛋白
- b. TATA区结合蛋白
- RNA聚合酶Ⅱ需要与其他转录因子结合，才能顺利起始转录。通常把辅助因子需要量最小的启动子称为一般性启动子（generic promoter），具有组成型表达特性，这些启动子上游调控区及所需转录因子在绝大多数甚至全部基因中都是高度保守的。
第37页：TBP与TFIID在DNA上的覆盖区域
TBP结合于DNA的小沟。TBP与DNA的结合在体外实验中保护了大约一圈双螺旋DNA免受核酸酶的降解，其覆盖的位置处于-37～-25。TAFs的加入延伸了对DNA的覆盖，整个TFIID复合物可覆盖-45～-10区域。
第38页：GC区结合因子SP1
- c. GC区结合因子
- GC区结合蛋白SP1是1.0×105的单体，能与DNA链上包括GGGCGG在内约20bp的序列特异结合。在SV40启动子区，从-70～-110的6个GC区全部与SP1结合，所以这个区域的DNA不会被降解。在胸腺嘧啶激酶启动子区，SP1既与上游的CTF（CAAT区结合蛋白）相互作用，又与下游的TFIID紧密相关。GC区对SP1的结合是必需的，但该序列对于SP1亲和力却很不相同，证明GC区两翼序列同样在SP1的识别及结合过程中发挥作用。人们推测GC区、尤其是多次重复的GC区，与基因的永久型表达有关。
第39页：Oct-1与Oct-2激活蛋白
- d. 八碱基对元件激活蛋白
- 八碱基对元件也能被多个激活蛋白识别。Oct-1是非淋巴样细胞中结合八碱基对元件的转录激活因子，没有组织特异性；Oct-2则是组织特异的激活因子。一般说来，一个特定的共有序列元件能被相应的转录因子或一个转录因子家族的成员所识别，而相同的元件也能被不同的转录因子所识别。
第40页：简单转录单位
五、真核基因转录后加工的多样性
1、简单转录单位：其初级转录产物通常只经一种加工途径，形成一种成熟的mRNA，编码单一的蛋白质产物。
第41页：复杂转录单位
2、复杂转录单位：含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子以外，其初级转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mRNA。
第42页：
第43页：多个加poly(A)位点与不同剪接
利用多个加poly（A）位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质。这类基因5'末端虽只有一个转录起始位点，但有两个或多个加poly（A）位点，因此可通过不同的剪接方式得到不同的蛋白质。
第44页：
第45页：mRNA的稳定性控制
3、mRNA稳定性控制：真核生物能否长时间、及时地利用成熟的mRNA分子翻译出蛋白质以供生长、发育的需要，是和mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除相关的。
- 原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3 min。
- 高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均3 h。
- 在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达数天。
第46页：
第47页：铁应答元件IRE与IREBP
转运铁蛋白受体（TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个mRNA上存在相似的顺式作用元件，称为铁应答元件（iron response element，IRE）。IRE与IRE结合蛋白（IREBP）相互作用控制了这两个mRNA的翻译效率。当细胞缺铁时，IREBP与IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白mRNA的翻译；与此同时，TfR mRNA上3'非翻译区中的IRE也与IREBP特异结合，有效地阻止了TfR mRNA的降解，促进TfR蛋白的合成。
第48页：
第49页：
第50页：蛋白质因子的修饰与翻译起始调控
4、蛋白质因子的修饰与翻译起始调控：用兔网织红细胞粗抽提液研究蛋白质合成时发现，如果不向这一体系中添加氯高铁血红素，网织红细胞粗抽提液中的蛋白质合成抑制剂就被活化，蛋白质合成活性在几分钟之内急剧下降，很快就彻底消失。现已查明，网织红细胞蛋白质合成的抑制剂HCI是受氯高铁血红素调节的eIF-2的激酶，可以使该因子的α-亚基磷酸化并由活性型转变为非活性型。
第51页：应答元件与真核基因表达调控举例
六、真核基因表达调控举例：现代分子生物学上把能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件（response element）。它们与细胞内高度专一的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。
最常见的应答元件有：热激应答元件（heatshock response element，HSE）、糖皮质应答元件（glucocorticoid response element，GRE）、金属应答元件（metal response element，MRE）。
第52页：基因敲除技术
七、真核基因表达研究方法与应用
1、基因敲除技术（Gene Knockout）：通过同源重组定点破坏或替换目标基因，观察表型变化以推断基因功能。
第53页：基因敲除的注意事项
注意事项：
- （1）有合适的胚胎干细胞（embryonic stem cells）
- （2）有已知的单拷贝基因位点
- （3）用线性载体或不能自我复制的载体
第54页：蛋白质相互作用Pull-down实验
2、蛋白质相互作用（Pull-down assay），Science, 289:1550-1554 (2000)：NFκB基因表达后导致细胞炎症，而NFκB基因的活化受炎症诱发因子的刺激。IKKα、IKKβ及NEMO（NFκB-essential modifier）抑制NFκB基因的表达。
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第57页：导弹药物与药物导向治疗
3、导弹药物——药物导向治疗：肿瘤或癌细胞表面通常过量表达某些特征性蛋白质（如人乳腺癌细胞表面的28 kD蛋白），可作为肿瘤导向治疗的作用靶。将抗体的某些部分与外毒素相连接，就可以把毒素直接送到病变细胞表面，有效地杀死病变细胞，保护健康细胞。
文献：Cell, 95:657-667 (1998)；Nature, 400:781-784 (1999)；Science, 288:859-863 (2000)；PNAS，In Press (2000)。
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