页数：75页文件大小：7.70 MB来源： 分子生物学ppt课件
本课件讲授RNA代谢，先比较转录与复制并说明大肠杆菌与真核生物RNA聚合酶的亚基组成，再梳理原核与真核转录过程及启动子终止子结构，随后展开mRNA、tRNA、rRNA前体的加工与内含子剪接，最后介绍逆转录、端粒酶与RNA复制。
分子生物学 RNA的代谢 第四章（RNA Metabolism）
本章主要内容
目的要求
一、DNA指导下的RNA的合成
1、与DNA复制的相同点：都需要模板；都以三磷酸核苷酸为底物（NTP或dNTP）；合成方向都是5'→3'。
2、转录与DNA复制的不同点
（二）DNA指导下RNA聚合酶：1、RNA聚合酶的催化性质
3、大肠杆菌的RNA聚合酶：全酶由5种亚基α2ββ'ωσ组成；σ因子与其它部分的结合不十分紧密，易于与β'βα2分离。没有σ、ω亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长，对起始无作用。σ称为起始因子。
| 亚基 | 基因 | Mr | 亚基数目 | 功能 |
|---|---|---|---|---|
| α | rpoA | 40,000 | 2 | 酶的装配，与启动子上游元件和活化因子结合 |
| β | rpoB | 155,000 | 1 | 结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键形成 |
| β' | rpoC | 160,000 | 1 | 与模板结合 |
| σ | rpoD | 32,000~92,000 | 1 | 识别启动子，促进转录的起始 |
| ω | — | 9,000 | 1 | 未知 |
说明：ω亚基的基因名原文未给出，以“—”占位。
4、真核细胞的RNA聚合酶（同样，真核RNA聚合酶无校对功能）
| 酶类 | 分布 | 产物 | α-鹅膏蕈碱的作用 | 分子量 | 反应条件 |
|---|---|---|---|---|---|
| RNA聚合酶Ⅰ | 核仁 | 5.8S、18S、28S rRNA | 不抑制 | 500 000 | 低离子强度，要求Mg2+或Mn2+ |
| RNA聚合酶Ⅱ | 核质 | mRNA、snRNA | 低浓度抑制 | ~700 000 | 高离子强度 |
| RNA聚合酶Ⅲ | 核质 | tRNA、5S rRNA | 高浓度抑制 | ~700 000 | 高Mn2+浓度 |
（三）大肠杆菌的转录过程
转录示意图（1）：展示RNA聚合酶全酶识别启动子、DNA局部解链并开始合成RNA的起始状态。
转录示意图（2）：展示转录泡结构——前方解螺旋、后方恢复螺旋，并标出模板链与编码链的相对位置。
转录示意图（3）：展示延伸阶段RNA链不断生长、转录泡沿DNA模板移动的状态。
利用足迹法（footprint）和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。足迹法即是将DNA起始转录的限制性片段分离后，用RNA聚合酶与之结合，再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不被水解，其余部分被水解成彼此只相差一个核苷酸的大小不等的片段，经凝胶电泳可测得酶结合部位的序列结构。
足迹法示意图：与RNA聚合酶结合的DNA片段被保护而不被DNA酶水解，在凝胶电泳图谱上形成一段缺失条带的“足迹”。
大肠杆菌RNA聚合酶的启动子：标出转录起始位点、上游-35区与-10区（pribnow box）的位置关系。
大肠杆菌不同的σ因子识别不同启动子：
图中所示：-35区是RNA聚合酶最先的结合部位，形成所谓“闭合复合物”，然后向下游移动至富含AT的-10区域，这是转录时开始解链的部位，此时形成“开放复合物”。
不依赖ρ-因子的终止子：含富GC的回文序列和寡聚U序列，转录后形成发卡结构使转录终止。
依赖ρ-因子的终止子的终止反应：ρ-因子为含六聚体的寡聚蛋白，具有依赖RNA的NTP酶活性，它结合于新生RNA上，借助水解NTP产生的能量推动RNA聚合酶向前移动；当酶遭遇终止子时暂停前进，ρ-因子追上酶，与酶相互作用释放RNA。ρ-因子还具有RNA-DNA解螺旋酶活性。
真核生物编码蛋白质的基因的启动子的一般特性：包含调节序列、起始子（Inr）、GC box与CAAT box等上游元件。本页原图在源文件中显示为“无法显示该图片”，文字部分据原文保留。
真核RNA聚合酶Ⅱ需要许多其它蛋白因子（通用转录因子与特异转录因子）共同参与，才能准确起始转录。
真核RNA聚合酶Ⅱ和转录因子在启动子上的装配：显示各转录因子与pol Ⅱ按顺序结合于启动子区域，组装成转录起始复合物。
（五）真核生物的转录过程
TFⅡF除了参与转录外，还与DNA损伤的修复有关。
（六）RNA生物合成的抑制剂（之一）：模板抑制剂
放线菌素D：模板抑制剂——展示放线菌素D的结构与作用，其发色团嵌入DNA的GC区域，阻断RNA聚合酶沿模板前进。
RNA生物合成的抑制剂（之二）：嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成，作为代谢拮抗物抑制合成酶类，或直接掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。
RNA聚合酶抑制剂（之三）
二、RNA转录后的加工
（一）原核生物RNA的加工：1、mRNA前体的加工
原核生物的mRNA大多不需要加工，一经转录即可直接转译。但有少数多顺反子mRNA需要内切酶切成更小单位。如核糖体大亚基蛋白L10和L7/L12与RNA聚合酶的β-亚基和β'-亚基的基因共处一个转录单位，转录出多顺反子后切成两部分：一个是核糖体蛋白的三个mRNA共同翻译；另一个是RNA聚合酶的两亚基共同翻译。细胞内RNA聚合酶的翻译水平远低于核糖体蛋白，将两者切开有利于各自翻译的调控。类似的加工在某些噬菌体中也很常见。
2、rRNA前体的加工（1）：前体约6500个核苷酸，经甲基化修饰后，由核酸内切酶RNaseⅢ、P以及核酸外切酶等逐步切割成熟。
Structure of E. coli 30S pre-rRNA：展示30S前体rRNA中16S、23S、5S rRNA及tRNA的排列顺序与酶切加工位点。
3、tRNA的加工（1）包括：
tRNA的加工（2）：图示tRNA前体经过两端切割、修剪、添加CCA与碱基修饰后形成成熟tRNA的过程。
（二）真核生物RNA的一般加工：转录初始产物为hnRNA（核内不均一RNA），经剪接与修饰后形成成熟mRNA。
真核mRNA前体的加工步骤：hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）的转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）的转录序列拼接上，真核生物一般为不连续基因。加工包括：
真核mRNA的5'—“帽子”加工：新生RNA的5'端三磷酸经水解、加GMP与甲基化，形成m7G5'ppp5'NmpNp-帽子结构，用于保护mRNA并参与翻译起始的识别。
真核生物mRNA 3'—“尾巴”的加工：内切酶识别加尾信号并切断转录产物，随后由多聚腺苷酸聚合酶在3'端添加polyA尾。
mRNA的内含子：图示真核基因转录产物中内含子（非编码）与外显子（编码）交替排列，需经剪接去除内含子后形成连续编码序列。
因发现断裂基因而获1993年诺贝尔生理学奖的 Richard J. Roberts 与 Phillip A. Sharp：二人发现真核基因的外显子被内含子隔断，据此提出断裂基因概念。
2、真核rRNA前体的加工：核仁中转录产生的前体rRNA经甲基化修饰与核酸酶逐步切割，加工生成成熟的18S、5.8S与28S rRNA。
3、真核tRNA前体的加工：切除居间序列、两端修剪、3'端添加CCA序列以及核苷酸修饰后形成成熟tRNA。
（三）RNA的拼接机理：大多真核生物基因是断裂基因，即含有内含子。断裂基因的转录产物必须通过拼接，去除插入部分（内含子，intron），使编码区（外显子，exon）成为连续序列。RNA的拼接方式：
核酶的发现：1981年Cech T在研究四膜虫（Tetrahymena thermophila）rRNA前体拼接过程中发现，此类拼接无需蛋白质的酶参与作用，它可自我催化完成。Cech称具有催化功能的RNA为核酶（ribozyme）。1989年Cech T和Altman S共同获诺贝尔化学奖，Altman S的贡献是发现RNase P中的M1 RNA单独也具有催化功能。核酶的发现改变了酶的化学本质是蛋白质的传统观念。
因发现核酶而获诺贝尔奖的两位科学家：The M1 RNA in ribonuclease P is catalytic；The intron in the pre-rRNA of Tetrahymena is self-spliced。
1、类型Ⅰ内含子的自我拼接：借助与鸟苷酸或鸟苷的作用，内含子自我催化，通过三次转酯反应完成拼接，切下L19 RNA。
L19 RNA或L19 IVS（含395个核苷酸）：I型内含子自我拼接后切下的内含子片段，可进一步形成具有催化活性的结构。
四膜虫rRNA前体中内含子Ⅰ（L19 RNA）的二级结构：展示其多个配对区与保守序列元件的折叠方式。
L-19 IVS functions as a real catalyst in the test tube：以标记底物与不同保温时间（minutes）测定，显示L19 RNA在试管中作为真正的催化剂催化C5的水解与连接。
L19 RNA催化的反应：展示内含子RNA以转酯反应切割并连接寡核苷酸底物的反应过程。
2、类型Ⅱ内含子的自我拼接：也是由内含子自我催化完成，但转酯反应无鸟苷的参与，两次转酯反应后内含子形成套索结构而切下。
细胞内存在许多种类的小分子RNA，其大小在100~300个核苷酸，称为核内小RNA（Small nuclear RNA，snRNA）。U系列的snRNA中尿嘧啶含量较高因而得名。这些小RNA与多种蛋白质结合形成snRNP参与核内RNA的加工。U1、U2、U4、U5、U6结合形成的snRNP参与hnRNA的拼接，U3 snRNP参与rRNA的拼接。
类型Ⅲ内含子的结构特点：标示内含子5'端与3'端边界序列以及内部靠近3'端的分支点（branch point）位置。
U2 hnRNA含与分支处互补的序列，U1 hnRNA含与内含子3'-端互补的序列，二者通过碱基配对识别并结合内含子的关键位点，启动拼接体的组装。
4、核内tRNA前体的酶促拼接（内含子Ⅳ的切除），依次需要：核酸内切酶、环磷酸二酯酶、激酶、连接酶、磷酸酯酶参与。
RNA拼接的意义：1、RNA的拼接是生物机体在进化历史中形成的，是进化的结果；2、RNA的拼接是基因表达的重要环节。RNA转录后通过拼接而抽取有用信息，形成连续的编码序列，并可通过选择性拼接控制生物机体生长发育，这是真核生物遗传信息精确调节和控制的方式之一。
RNA拼接现象的发现带来一系列疑问：为什么生物机体要先转录内含子然后将其切除？RNA合成后再拼接非常耗能，对细胞的收益是什么？内含子由何而来？内含子有无生物功能？目前尚无定论。
（四）不同RNA拼接方式导致一个基因多种产物：降钙素基因在甲状腺中产生降钙素，在脑中经不同拼接产生降钙素基因相关肽（CGRP）。
真核生物复杂转录产物的两种不同的剪接方式：同一转录产物经不同剪接路径可产生多种成熟mRNA，从而翻译出功能不同的蛋白质。
三、逆转录（reverse transcription）
用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响；已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA，故Temin于1964年提出前病毒的假说。
逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿5'→3'方向合成DNA，底物为四种dNTP，并要求短链RNA作引物。逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：
过程：+RNA → RNA-DNA杂交分子 → 双链DNA（前病毒），以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化。
逆转录病毒的生活史：病毒颗粒吸附进入细胞后，以病毒RNA为模板逆转录生成DNA并整合为前病毒，再转录出病毒RNA并翻译病毒蛋白，最后装配成新的病毒颗粒释放。
逆转录酶发现的理论与实践意义：不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA；促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索；目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。1983年发现人类免疫缺陷病毒（HIV），感染T淋巴细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（AIDS），该病毒为逆转录病毒。
因发现逆转录病毒的遗传物质而获1975年诺贝尔奖的三位科学家（Temin、Baltimore与Dulbecco），其工作确立了RNA肿瘤病毒经DNA中间体复制的机制。
端粒（telomere）是真核染色体末端的特殊结构，一般含许多串联重复的寡聚核苷酸序列，通常是TxGy的形式，x、y常为1-4。线形DNA分子复制结束后引物去除留下的链短缺无法补缺，若没有特殊机制解决末端复制，DNA就会因复制而不断变短。
端粒酶（telomerase）含有一段RNA和蛋白质，其中RNA成分为150个核苷酸，并含1.5个拷贝的与端粒互补的重复序列CyAx，这是端粒TxGy合成的模板。端粒酶是以该段RNA为模板的逆转录酶，合成时以该段RNA为引物和模板，补全因引物切除而产生的DNA末端缺口，使染色体的端粒达到正常的长度。
端粒的合成：端粒酶以自身RNA为模板，在染色体3'端反复添加重复序列单位，合成出足够长度的端粒后再由常规复制机制补齐互补链。
四、RNA的复制（噬菌体Qβ和灰质炎病毒）
两个阶段：
RNA复制酶的催化性质
病毒RNA的复制方式
本章主要内容
生物化学 RNA的代谢（RNA Metabolism）完。
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