08 DNA或蛋白质的化学修饰与基因表达.ppt

第1页：分子生物学实验课程说明

分子生物学实验

课程名称

分子生物学实验技术

学分/学时

1.5/36

课程层次

专业必修课

修读类型

必修

考核方式

实验报告、笔试

适用专业

生物技术专业

第2页：实验目录

目录

• 实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定
• 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取
• 实验三、琼脂糖凝胶电泳
• 实验四、DNA的限制性酶切
• 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化
• 实验六、PCR基因扩增技术

第3页：实验一标题页

实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定

第4页：实验一目的

一、实验目的

• 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法。
• 学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。

第5页：实验一原理

二、实验原理：用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RNase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。

根据核酸与蛋白质分别在OD₂₆₀和OD₂₈₀有吸收峰分别测定之，比较OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。

第6页：实验一材料

三、实验材料与试剂物品

1.材料

香椿（Toona sinensis）黄花苗

第7页：实验一试剂

2、试剂

提取缓冲液（预冷）、SSC、RNase液

第8页：实验一仪器设备

3、仪器设备

高速冷冻离心机、制冰机、紫外可见分光计、冰箱（-86度、-20度、4度）、水浴锅、电子天平、玻璃仪器等。

第9页：实验一操作流程

四、实验操作流程：采摘芽苗，洗净→剪小段，擦干表面水分→放-86度冰箱冻30分钟以上→冰浴研磨匀浆（分次加提取液）→以下见讲义。

第10页：实验一结果与处理

五、结果与处理

• 纯度
• 含量

第11页：实验一思考题

思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？

第12页：实验二标题页

实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取

第13页：实验二目的与要求

1.目的与要求：通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。

第14页：质粒的概念

2.相关知识及原理

质粒（Plasmid）

独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

第15页：

第16页：

第17页：

第18页：常用质粒载体

常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的，如pUC18、pUC19（500~700）。

第19页：细菌质粒的大小与复制

细菌质粒

是用的最多的质粒类群，其大小从1 Kb-200 Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。

第20页：严谨型与松弛型质粒

质粒类型

• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝。
• 松弛型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

第21页：载体的概念与必备条件

载体（Vector）

用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒（运载工具）。

具备的条件：

• 易于鉴定；
• 在受体细胞中可以独立复制；
• 易于筛选；
• 易于导入受体细胞。

第22页：质粒载体图谱示意

本页为质粒载体结构示意，标注插入片段（Insert）与EcoRI、XhoI酶切位点及1.9 kb片段的位置关系，建议对照原课件图片查看。

第23页：载体的四个结构元件

载体的结构

• 1.抗性基因（Antibiotic resistance gene，such as Ampicillin resistance gene、Kanamycine resistance gene）
• 2.启始复制子（ori，Origin of replication）
• 3.多克隆位点（MSC，Multiple cloning site or polylinker）
• 4.标记基因（Marker gene，such as LacZ gene）

第24页：Amp抗性基因的作用

Amp^r抗性基因

编码一种周质酶（β-内酰胺酶），可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力。

第25页：碱法提取质粒的原理

二、实验原理

• 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性pH，DNA变性；恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。
• 碱性下变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

第26页：DNA的变性与复性条件

DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。

第27页：SDS裂解与碱变性提取流程

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA由于分子巨大难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

第28页：细菌裂解的三种方法

细菌裂解的方法

• 碱裂解法：0.2 mol NaOH + 1% SDS
• 煮沸裂解法：沸水煮沸40秒
• SDS裂解法：10% SDS，一般用于质粒大量提取

第29页：质粒提纯的思路

提纯的思路

• 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA
• 要去除的物质：蛋白、基因组DNA、脂类及小分子杂质、RNA

第30页：DNA浓度的测定方法

DNA浓度的测定

测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。

第31页：紫外吸收法测DNA浓度

紫外光吸收法

因为组成核酸的碱基（G、A、T、C）在260 nm处具有强吸收峰，所以通过测定260 nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同，因此一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。

第32页：实验二材料

3.材料与试剂

材料

含有质粒大肠杆菌JM83+。

第33页：实验二仪器、材料与试剂作用

三、实验仪器、材料与试剂

• （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅
• （二）材料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基
• （三）试剂：溶液Ⅰ作用为分散细胞，螯合金属离子使金属酶失活；溶液Ⅱ作用为细胞壁肽聚糖碱性下水解、核酸和蛋白质变性；溶液Ⅲ作用为酸性下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，K⁺可中和DNA。

第34页：三种溶液的配方

溶液1－GET缓冲液：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mM Tris-HCl pH 8.0。

溶液2－0.2 mol/L NaOH，1% SDS。

溶液3－乙酸钾溶液（3 M，pH=4.8）：60 mL的5 mol/L KAc，11.5 mL冰醋酸，28.5 mL H₂O。

TE缓冲液或水（+20 μg/ml RNase）：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0，100%乙醇，70%乙醇。

第35页：酚氯仿抽提与乙醇沉淀

• 平衡酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；平衡酚pH 7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中；异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。
• 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀。
• TE缓冲液：溶解DNA。

第36页：实验二操作步骤（上）

四、实验步骤：

• 接含质粒的单菌落于3 ml LB Amp+液体培养基中
• 37 ℃，190 rpm振荡培养过夜
• 取1.5菌液入1.5 ml的dorf管中，6000 rpm、离心2 min，弃上清，收集菌体
• 100 μL溶液Ⅰ悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10 min
• 加入200 μL溶液Ⅱ（轻轻混匀），冰上静置5 min裂解菌体

第37页：实验二操作步骤（下）

• 加入150 μL溶液Ⅲ（轻轻混匀），冰上静置15 min，质粒DNA复性
• 12000 rpm，离心15 min，取上清记录体积到一新管
• 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
• 12000 rpm，离心15 min，取上清记录体积到一新管
• （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
• 12000 rpm，离心15 min，取上清记录体积到一新管
• 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30 min

第38页：质粒沉淀的洗涤与溶解

• 12000 rpm，离心15 min
• 沉淀用75%乙醇1 mL洗涤两次（振荡混匀、离心）
• 12000 rpm，离心10 min
• 沉淀超净台中风干
• 沉淀用20 μL RTE溶解，-20 ℃保存

第39页：操作注意事项

注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液Ⅱ和Ⅲ后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA（包括质粒DNA和基因组DNA）！

第40页：质粒小量提取手工法（上）

质粒小量提取的方法（手工提取）：

• 1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3 ml含有相应抗生素的液体培养基，37 ℃培养12~16小时。
• 2.取液体培养液1.5-2 ml于Eppendorf管中，10000 r/min离心1 min，去掉上清液，加入100 μl溶液1（GET），充分混匀放置3-5分钟。
• 3.加入200 μl新配制的0.2 mol/L NaOH + 1% SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5 min。

第41页：质粒小量提取手工法（下）

• 4.加入150 μl乙酸钾溶液（溶液Ⅱ），加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5 min。
• 5.用冷冻高速离心机，10000 r/min离心7 min，上清移入另一干净离心管，并加1 ml 100%乙醇混匀，12000 r/min离心5 min，弃去上清液。
• 6.沉淀用0.5 ml 70%乙醇清洗一次，12000 r/min离心5 min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。
• 7.加入30-50 μl含有20 μg/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30 min，使DNA充分溶解（有时需要酚:氯仿抽提）。
• 8.将分离出的质粒DNA置于-20 ℃保存备用。

第42页：分光光度计法测定DNA（一）

B.用分光光度计法定量DNA

• 1.取2 μl提取的质粒DNA，加入98 μl蒸馏水对待测DNA样品做1:50（或更高倍数的）稀释。
• 2.蒸馏水作为空白，在波长260 nm、280 nm处调节紫外分光光度计读数至零。

第43页：分光光度计法测定DNA（二）

• 3.加入DNA稀释液，测定260 nm及280 nm的吸收值。260 nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD₂₆₀值为1相当于约50 μg/ml双链DNA、33 μg/ml单链。可根据在260 nm以及在280 nm的读数的比值（OD₂₆₀/OD₂₈₀）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。

第44页：DNA浓度计算公式

4.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下：

dsDNA = 50 ×（OD₂₆₀）× 稀释倍数

以上浓度单位为μg/ml。

第45页：实验三标题页

实验三、琼脂糖凝胶电泳

第46页：实验三目的

一、实验目的：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

第47页：琼脂糖凝胶电泳的原理

二、实验原理

• DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
• 核酸为两性分子，在pH 3.5时整个分子带正电；pH 8左右时碱基几乎不解离，整个分子带负电。
• 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。
• 可以分离相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

第48页：实验三仪器材料与试剂

三、仪器、材料与试剂

• （一）仪器
• （二）材料：1.自己提取的质粒DNA；2.相对分子质量标准品
• （三）试剂：1. 5×TBE储液（pH 8.0），使用时稀释10倍成0.5×TBE（1×TBE也可）；2.凝胶加样缓冲液（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖）；3.琼脂糖；4.10 mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4 ℃保存，用时稀释成5 μg/ml的EB。

第49页：实验三操作步骤

四、实验操作步骤

• 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）
• 凝胶板的制备
• 加样（加样体积在10~30 μl）
• 电泳
• 染色
• 结果观察

第50页：凝胶电泳检测DNA浓度

C.凝胶电泳检测DNA的浓度：0.8%的琼脂糖凝胶，100 V，40分钟。NEB标准分子量片段（1 kb DNA Ladder）。

第51页：1 kb DNA Ladder各条带质量

1 kb DNA Ladder各片段大小与质量（按0.5 μg上样量计，应按13条带计算，因为3 kb的量是其它片段量的近三倍）：

注：0.5 kb的条带由500 bp和517 bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。表中编号与碱基对数值原文存在数字粘连（如“110,00242 ng”），已按1 kb DNA Ladder标准片段拆分还原。

第52页：琼脂糖的相关知识

相关知识

• 电泳：泳动速度决定于？
• 琼脂糖凝胶：天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80%）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷；而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

第53页：琼脂糖浓度与分离范围

核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系：

第54页：核酸构型与电泳分离的关系

核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

第55页：影响迁移率的因素

影响迁移率的因素

DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5 V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。

第56页：常用核酸染料EB与SYBR

常用染料

• EB：溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，Ethidium Bromide），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260 nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360 nm吸收的射线，均可在可见光区以590 nm波长发射出来，呈橙红色。
• EB染料优点：染色操作简便、快速，室温下15-20 min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10 ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。
• EB是诱变剂，使用时一定要戴手套，EB废液要经过处理才能丢弃。
• SYBR：新型低毒、高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。

第57页：实验三结果与讨论

五、实验结果与讨论

• 根据观察结果，绘图。
• 分析自提质粒的情况。

第58页：实验四标题页

实验四、DNA的限制性酶切

第59页：限制性内切酶的发现与功能

一、实验目的及背景

• 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现的，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。
• 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5'端为P，3'端为OH。

第60页：限制酶的类型

限制酶的类型

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

• Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
• Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
• Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
• 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。

第61页：Ⅱ型限制性内切酶

Ⅱ型酶

就是通常指的DNA限制性内切酶。

• 它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。
• Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg²⁺作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序。
• Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口——5'端突出、3'端突出和平末端。
• 正是得益于限制性内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。

第62页：酶切反应中内切酶的注意事项

酶切反应中应注意以下几个问题：

1.内切酶

• 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染。
• 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端。
• 内切酶的用量根据内切酶单位和DNA用量而定，通常1 u指在适当条件下1小时内完全酶解1 μg特定DNA底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以1 μg DNA对2-3 u酶短时间为宜。
• 同时内切酶体积不能超过反应体系10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶活力。
• 使用时防止操作中对内切酶的污染。

第63页：酶切反应中DNA的注意事项

2.DNA

作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20 U/μg DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂、或延长反应时间加以克服。

第64页：酶切反应缓冲液

3.反应缓冲液

反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg²⁺组成，其中Mg²⁺为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成3种级别的离子强度：低盐（10 mM NaCl）、中盐（50 mM NaCl）、高盐（100 mM NaCl）。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。

第65页：酶解温度与时间

4.酶解温度与时间

大多数限制酶反应温度为37 ℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50 ℃下进行反应。反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶:DNA = 2-3:1，2小时即可充分酶解。

第66页：实验四试剂

二、实验试剂

• 限制性内切酶
• DNA（λDNA和质粒DNA）
• 10×buffer：50 mM Tris HCl pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl₂
• 无菌水

第67页：酶切反应体系

三、实验方法

1.按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中：

• DNA 1 μl
• 10×buffer 2 μl
• 无菌水 20 μl
• 内切酶 2 μl
• 总体积：25 μl

第68页：酶切操作流程

• 2.将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
• 3.Eppendorf管封上封口膜于37 ℃水管中反应1小时。
• 4.反应结束后加入4 μl的10× Loading buffer以终止反应。
• 5.混匀后0.8%琼脂糖凝胶上60伏电泳2小时。
• 6.紫外透射仪上检查实验结果。

第69页：实验四结果分析与讨论

四、结果与分析：

• 1.记录紫外透射仪上观察到的结果。
• 2.分析实验结果的成因。

问题与讨论：

• 1.在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？
• 2.如何选择DNA和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10%？

第70页：实验五标题页

实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化

第71页：实验五目的

实验目的

• 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
• 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
• 3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

第72页：转化的概念

实验原理

转化（Transformation）

是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。

第73页：转化中的受体细胞

转化中的受体细胞

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R^-M^-符号表示。

第74页：转化方法与感受态细胞

• 转化方法：电击法、CaCl₂、RuCl等化学试剂法。
• 感受态细胞：处理后细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。
• 转化细胞（转化子）：带有异源DNA分子的受体细胞（Transformant）。

第75页：CaCl2转化与抗性筛选原理

本实验以E. coli JM83^-菌株为受体细胞，用CaCl₂处理受体菌使其处于为感受态，然后与质粒共保温，实现转化。因质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Amp^r符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。

第76页：抗性筛选平板示意

本页为抗性筛选结果示意，对比抗Amp宿主细菌在含Amp培养基上的生长情况，建议对照原课件图片查看。

第77页：影响转化率的因素

影响转化率的因素

• 细胞生长状态和密度。
• 转化的质粒DNA的质量和浓度。
• 试剂的质量。
• 防止杂菌和其它外源DNA的污染。

第78页：实验仪器

实验仪器：本页源文件未提取到具体仪器清单文字，建议对照原课件图片补充。

第79页：实验五试剂

实验试剂：大肠杆菌JM83^-、LB培养基、0.1 mol/L CaCl₂溶液（预冷）、氨苄青霉素、JM83⁺质粒。

第80页：实验五步骤概览

实验步骤

• 菌株活化
• 感受态细胞制备
• 外源DNA的转化

第81页：菌株活化步骤

实验步骤·菌株活化

• 1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM83^-，在LB培养基平板表面划线，于37 ℃培养16小时。
• 2.挑取一个单菌落，转到3-5 ml LB培养基中，于37 ℃培养3-5小时。
• 3.将培养液全部转到100 ml LB培养基中培养2-3小时，到OD₆₀₀＝0.3-0.4。

第82页：感受态细胞制备步骤

实验步骤·感受态细胞制备

• 4.将培养液转入1.5 ml离心管中，在冰上放置15-30 min。
• 5.4000 rpm离心5 min，弃上清。
• 6.加入0.8 ml预冷的0.1 mol/L CaCl₂，悬浮沉淀，冰上预冷10 min。
• 7.4000 rpm离心5 min，弃上清。
• 8.加入0.2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl₂，悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15%的甘油在-70 ℃长期保存。

第83页：外源DNA转化步骤

实验步骤·转化

• 9.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30 min。
• 10.于42 ℃水浴90 s。
• 11.冰上放置2 min。
• 12.加入800 μl LB液体培养基于37 ℃培养1小时。
• 13.将培养液均匀涂布在含Amp⁺的培养基平板上。
• 14.将平板放置于37 ℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果。

第84页：转化实验的两个对照组

对照组

• 对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
• 对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5 μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

第85页：转化率与转化效率统计

转化率统计：每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

• 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
• 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）
• 感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
• 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

第86页：实验结果

实验结果：本页源文件未提取到具体实验数据，建议对照原课件图片补充。

第87页：实验报告要求

实验报告

• 写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂。
• 详细列出实验步骤。
• 画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。

第88页：实验六标题页

实验六、PCR基因扩增技术

第89页：实验六目的

实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

第90页：PCR的概念与扩增倍数

实验原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2ⁿ倍。

第91页：PCR的三步反应

PCR技术的原理

• 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。
• 2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。
• 3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5'→3'的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。

第92页：靶DNA扩增示意

本页为靶DNA扩增原理示意，标注引物1、引物2及其互补链和单位长度与不同长度链的生成关系，建议对照原课件图片查看。

第93页：

第94页：

第95页：

第96页：

第97页：

第98页：PCR反应的温度循环周期

PCR反应的温度循环周期：PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min。

第99页：一般PCR反应条件

一般PCR反应条件：本页源文件未提取到具体条件参数文字，建议对照原课件图片补充。

第100页：实验仪器：电泳仪

实验仪器：电泳仪。

第101页：实验仪器：琼脂糖凝胶电泳槽

实验仪器：琼脂糖凝胶电泳槽。

第102页：实验仪器：PCR仪

实验仪器：PCR仪。

第103页：实验仪器：凝胶成像系统

实验仪器：凝胶成像系统。

第104页：实验仪器：移液器

实验仪器：移液器。

第105页：实验材料

实验材料

• 1、DNA模板
• 2、4种dNTP
• 3、引物1、引物2
• 4、Taq酶
• 5、琼脂糖
• 6、DNA相对分子质量标准物
• 7、吸头、50 μl PCR管

第106页：PCR试剂与引物序列

试剂：10×PCR缓冲液（含Mg²⁺）、4×dNTP（每种1 mmol）、Taq酶1 U/μl、DNA模板。

• 引物1：5'-GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3'
• 引物2：5'-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3'
• 引物溶液浓度10 pmol/μl

第107页：PCR反应体系加样量

实验步骤：1.在0.5 ml PCR管内配置20 μl反应体系：

第108页：PCR反应程序

PCR反应程序：

• （1）94 ℃变性5 min
• （2）94 ℃变性1 min
• （3）52 ℃退火1 min
• （4）72 ℃延伸1 min
• （5）重复（2）-（4）30次
• （6）72 ℃延伸1 min

第109页：实验报告要求

实验报告要求：

• 1、写出本实验目的、原理；
• 2、实验器材及实验步骤；
• 3、列出实验结果示意图并分析原因。

第110页：PCR实验结果

实验结果：PCR结果。1、对照（无模板）；2-6、PCR产物（5 μl样品）。