第1页：第14章 基因重组与基因工程
14基因重组与基因工程Chapter 14 gene recombinationand genetic engineering
第2页：分子杂交与印迹技术
第一节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & BlottingTechnology
第3页：核酸分子杂交在
- 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization )在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)
- 一、分子杂交与印迹技术的原理
第4页：复性
复性RNADNA
第5页：探针技术探针一小段用同位素
- 1、印迹技术
- 2、探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在
第6页：印迹技术的类别及应用
- 二、印迹技术的类别及应用1、DNA印迹技术(Southern blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。2、RNA印迹技术(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析
- 3、蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究
第7页：其他斑点印迹原位杂交
其他斑点印迹(dot blotting)原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵(DNA array)DNA芯片技术(DNA chip)
第8页：三种印迹技术的比较
三种印迹技术的比较
第9页：分子杂交实验
分子杂交实验①②③
第10页：放射自显影照片
放射自显影照片
第11页：DNA点阵
DNA点阵
第12页：聚合酶链式反应
第二节聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction（PCR)
第13页：基本工作原理
- 5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 1555555Template DNA55555555
- 一、基本工作原理
第14页：模板DNA的含量可以扩大100万倍以上
Cycle 3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。
第15页：PCR体系基本组成成分
- 模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+
- 二、PCR体系基本组成成分
第16页：PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72
三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C
第17页：基因的体外突变
- 1、目的基因的克隆
- 2、基因的体外突变3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列测定
- 5、基因突变分析
- 四、PCR的主要用途
第18页：几种重要的PCR衍生技术
- 五、几种重要的PCR衍生技术
- 1、反转录PCR技术
- 2、原位PCR技术
- 3、实时PCR技术
第19页：实时PCR技术原理
实时PCR技术原理
第20页：核酸序列分析
第三节核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis
第21页：核酸序列分析的基本原理化学裂解法
核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)
第22页：化学裂解法基本原理基于某些化学试剂可以使
- 一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
- 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
第23页：
第24页：
第25页：DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记
- 三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。
- 用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
第26页：
第27页：基因文库
第四节基因文库Gene Library
第28页：基因组DNA文库
- •基因组DNA文库(genomic DNA library)
- •cDNA文库(cDNA library)基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体
第29页：基因组DNA文库（续）
基因组DNA文库
第30页：第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库
第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例
第31页：疾病相关基因的克隆与鉴定
第五节疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of DiseaseRelative Genes
第32页：功能性克隆二
- 克隆疾病相关基因的策略
- 一、功能性克隆(functional cloning)
- 二、定位克隆(positional cloning)
- 三、非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)
- 四、定位候选基因克隆策略(positionalcandidate gene approaches )
第33页：功能性克隆应用生化机制已明确
- 定义从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因
- 一、功能性克隆应用生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病
第34页：利用特异性抗体筛选表达型
- 克隆方式
- ①利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库
- ②根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。功能互补试验(functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因
第35页：遗传学分析交换分析
- 二、定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作
- ①遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析
- ②分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆
第36页：非定位候选基因克隆策略由于基因组作图的完
三、非定位候选基因克隆策略由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。
第37页：定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定
四、定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。
第38页：遗传修饰动物模型的建立及应用
第六节遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application ofHeredity-Modified Animal Model
第39页：转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合
- 转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)——目的基因的受体动物
- 一、转基因技术
第40页：
第41页：核转移技术
- 核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)
- 二、核转移技术
第42页：基因剔除技术
- 基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术
- 三、基因剔除技术
第43页：基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立
- 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型
- ①单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-function mutation)
- ②多基因决定疾病模型
第44页：生物芯片技术
第七节生物芯片技术Biological Chip Technology
第45页：DNA芯片•cDNA芯片是指将许多特定
- •DNA芯片(DNA chip)
- •cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上
- 一、基因芯片基因芯片(gene chip)
第46页：
第47页：是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固
- 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术
- 二、蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)
第48页：蛋白质相互作用研究技术
第八节蛋白质相互作用研究技术Research Technology of Interactionof Protein
第49页：蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成
- 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。
- 几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。
- 蛋白质之间相互作用研究的重要性
第50页：酵母双杂交各种亲和分析荧光共振能量转换效
酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术
第51页：酵母双杂交技术的基本原理
一、酵母双杂交技术的基本原理
第52页：分析已知蛋白之间的相互作用
- 二、酵母双杂交系统的应用
- 1、分析已知蛋白之间的相互作用
- 2、对蛋白质功能域的分析
- 3、分析未知蛋白相互作用
- 4、绘制蛋白质相互作用系统图谱
- 5、在药物设计中的应用
第53页：重组DNA技术
第九节重组DNA技术
第54页：重组DNA技术又称为基因工程或分子克隆
- 重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆(molecularcloning)。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成
- ①载体和目的基因的分离
- ②载体和目的基因的切断
- ③载体和目的基因的重组
- ④重组DNA的转化和扩增
- ⑤重组DNA的筛选和鉴定
第55页：载体和目的基因的分离为了进行基因重组
- 一、载体和目的基因的分离为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。
- （一）载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
- 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
第56页：质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细
- 1．质粒：是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。
- 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。
第57页：质粒pUC19的分子结构
质粒pUC19的分子结构
第58页：噬菌体：可通过转染方式将其
- 2．噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。
- 常用的为人工构建的λ噬菌体载体。
- 噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；
- 而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。
- 目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。
第59页：病毒：常用的为SV40
- 3．病毒：常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。
- 目前应用相对较少。
第60页：直接从染色体
- （二）目的基因：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行
- 1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用
- 2．人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因
第61页：从mRNA合成
- 3.从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。
- 这一方法通常可得到可表达的完整基因。
第62页：从基因文库中筛选
- 4．从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomicDNAlibrary)。
- 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。
- C-文库具有组织细胞特异性。
第63页：基因组文库的制作
基因组文库的制作
第64页：利用PCR合成
- 5．利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。
- 但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。
第65页：载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内
- 二、载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。
- 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。
- 由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。
- 形成粘性末端(cohesiveend)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。
第66页：载体和目的基因的重组即将带有切口的载体与
- 三、载体和目的基因的重组即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。
- （一）粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。
- 如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。
- 较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。
第67页：载体DNA与目的基因的连接
载体DNA与目的基因的连接
第68页：人工接尾法：即同聚物加尾连接法
- （二）人工接尾法：即同聚物加尾连接法。
- 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。
- 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
第69页：人工接头连接法
（三）人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。
第70页：重组DNA的转化和扩增重组
- 四、重组DNA的转化和扩增重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。
- 重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。
第71页：如果是用λ噬菌体作为载体的重组体
- 如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。
- 重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。
- 对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。
第72页：重组DNA的筛选和鉴定由于重组体导入宿主
- 五、重组DNA的筛选和鉴定由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。
- 可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。
- 如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。
- 在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。
第73页：插入灭活法筛选重组体
插入灭活法筛选重组体
第74页：根据标志互补进行筛选
- （二）根据标志互补进行筛选：当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。
- 即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。
第75页：根据DNA限制酶谱进行分析
- （三）根据DNA限制酶谱进行分析：经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。
- 将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。
第76页：用核酸杂交法进行分析鉴定
（四）用核酸杂交法进行分析鉴定：为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。
第77页：获得带目的基因的细菌后
- 获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。
- 如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。
第78页：发现疾病基因
- （三）重组DNA技术与医学的关系
- 1、发现疾病基因
- 2、发展生物制药
- 3、基因治疗
- 4、遗传病的预防
