页数：48页文件大小：6.94 MB来源： 酶工程ppt课件
本课件讲述酶的提取、分离与纯化，先给出由细胞破碎、酶提取、分离纯化到浓缩贮存的技术路线与粗纯化三阶段，再逐一比较沉淀、离心、过滤与膜分离、层析、电泳、萃取六大分离方法的原理与适用对象，最后说明组合纯化策略与浓缩、干燥、结晶的工艺要求。
本章为《酶工程》第三章，主题为酶的提取、分离和纯化，包括技术路线、细胞破碎、酶的提取、分离方法、组合分离纯化策略以及浓缩、干燥与结晶。
技术路线：细胞破碎 → 酶提取 → 酶分离纯化 → 酶浓缩 → 酶贮存。原料为动物、植物或微生物细胞及发酵液。
分离纯化常用手段包括离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶分离等。
酶的纯化过程约可分为三个阶段：
| 阶段 | 主要操作 |
|---|---|
| 粗蛋白质 crude protein | 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法，可粗略去除蛋白质以外的物质 |
| 部分纯化 partially purified | 初步纯化，使用各种柱层析法 |
| 均质酶 homogeneous | 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或 HPLC |
许多酶存在于细胞内，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理，常用设备包括超声波细胞粉碎机、细胞破碎珠、高压细胞破碎机与电动玻璃匀浆机等。
| 破碎方法 | 具体方式 | 原理 |
|---|---|---|
| 机械破碎 | 捣碎法、研磨法、匀浆法 | 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎 |
| 物理破碎 | 温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法 | 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎 |
| 化学破碎 | 有机溶剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿）、表面活性剂（Triton、Tween） | 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 |
| 酶促破碎 | 自溶法、外加酶制剂法 | 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 |
溶剂选择原则：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性有机溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；与脂质结合或含较多非极性基团的酶可用有机溶剂提取。
提高温度、降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离、增大浓度差等有利于提高酶分子的扩散速度，增大提取效果；同时需控制好温度、pH 值以防止酶变性失活。
| 提取方法 | 使用的溶剂或溶液 | 提取对象 |
|---|---|---|
| 盐溶液提取 | 0.02～0.5 mol/L 的盐溶液 | 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 |
| 酸溶液提取 | pH 2～6 的水溶液 | 用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 |
| 碱溶液提取 | pH 8～12 的水溶液 | 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 |
| 有机溶剂提取 | 可与水混溶的有机溶剂 | 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 |
大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度升高而增加，这称为盐溶现象。
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
| 沉淀分离方法 | 分离原理 |
|---|---|
| 盐析沉淀法 | 利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，添加一定浓度的中性盐使酶或杂质析出沉淀 |
| 等电点沉淀法 | 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同两性电解质有不同等电点，调节 pH 值使酶或杂质沉淀 |
| 有机溶剂沉淀法 | 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添加一定量有机溶剂使酶或杂质沉淀 |
| 复合沉淀法 | 加入某些物质与酶形成复合物而沉淀下来 |
| 选择性变性沉淀法 | 选择一定条件使某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶 |
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。
常用中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠，其中以硫酸铵最为常用：溶解度大、温度系数小、不影响酶活性、分离效果好且价廉易得。缺点是缓冲能力较差，铵离子会干扰蛋白质测定。盐析时硫酸铵浓度通常以饱和度表示。
有机溶剂使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂使溶液的介电常数降低。例如 20 ℃ 时水的介电常数为 80，而 82% 乙醇水溶液的介电常数为 40。介电常数降低使溶质分子间静电引力增大而易于凝集；同时有机溶剂与水相互作用破坏溶质分子表面的水膜，也使溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
离心分离是借助离心机旋转产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
| 离心机类型 | 最大转速 | 相对离心力 RCF | 主要用途 |
|---|---|---|---|
| 常速离心机 | 8000 r/min 以内 | 1×104 g 以下 | 细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物分离，也用于酶结晶等较大颗粒 |
| 高速离心机 | （1～2.5）×104 r/min | 1×104～1×105 g | 沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离，可配冷冻装置防止酶变性失活 |
| 超速离心机 | （2.5～12）×104 r/min | 可达 5×105 g 甚至更高 | DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及细胞器、病毒的分离纯化，纯度检测，沉降系数与相对分子质量测定 |
超速离心机按用途可分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机 3 种。
蛋白质分子的分子量、分子密度、组成、形状等均会影响其沉降速率，沉降系数即用来描述此沉降性质，单位为 S（Svedberg unit），与分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质可利用超速离心在密度梯度中作分离。
过滤是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程，常用介质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜。
| 类别 | 截留颗粒大小 | 截留的主要物质 | 过滤介质 |
|---|---|---|---|
| 粗滤 | > 2 μm | 酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等 | 滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等 |
| 微滤 | 0.2～2 μm | 细菌、灰尘等 | 微滤膜、微孔陶瓷 |
| 超滤 | 20 Å～0.2 μm | 病毒、生物大分子等 | 超滤膜 |
| 反渗透 | < 20 Å | 生物小分子、盐、离子 | 反渗透膜 |
借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状和特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。薄膜主要由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成，有时也可采用动物膜。
根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：
| 膜技术 | 截留物尺寸 nm（分子量） | 推动力 | 分离机理 |
|---|---|---|---|
| 微滤 MF | > 20（> 40,000） | 压力差，> 100 kPa | 筛分 |
| 超滤 UF | 1～20（10,000～40,000） | 压力差，> 100 kPa | 筛分 |
| 纳滤 NF | > 1（100～1000） | 压力差，< 1000 kPa | 优先吸附、表面电位 |
| 反渗透 RO | （> 100） | 压力差，> 1000 kPa | 优先吸附、溶解扩散 |
注：源文件数字存在粘连，本表按列名与常规数值区间推断切分，反渗透一行的分子量栏原文缺失，建议对照原图核对。
本页图示四种常用膜分离过程（微滤、超滤、纳滤、反渗透）的截留特性，横轴为截留物尺寸，各过程按孔径由大到小依次覆盖不同粒径与分子量区间。建议对照原图核对各过程的截留边界数值。
层析技术亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它利用混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相与流动相两个相中，流动相流过固定相并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
| 层析方法 | 分离依据 |
|---|---|
| 吸附层析 | 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使各组分分离 |
| 分配层析 | 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 |
| 离子交换层析 | 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 |
| 凝胶层析 | 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而达到物质分离 |
| 亲和层析 | 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 |
| 层析聚焦 | 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 |
吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使各组分分离，是应用最早的层析技术，吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，设备简单。
通常采用柱型装置：混合溶液自柱顶加入，样品液全部进入吸附柱后加入洗脱剂解吸洗脱，柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。洗脱方法包括：
分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离。分配系数是一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中浓度的比值；在层析条件确定后为一常数。
通常以多孔性固体支持物（滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，另一种互不相溶的溶剂沿固定相流动成为流动相，溶质在两相间进行连续的动态分配。常见形式有：
离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。离子交换剂是在不溶性高分子母体（如树脂）上引入若干可解离基团制成，按活性基团性质分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
由于酶分子具有两性性质，所以既可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
凝胶层析又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析，是以多孔凝胶为固定相，利用各组分的相对分子质量不同而分离的技术。
大分子物质分子直径大，不能进入凝胶微孔，只分布于凝胶颗粒间隙，以较快速度流过凝胶柱；较小的分子能进入凝胶微孔，不断进出于颗粒微孔内外，向下移动速度较慢。因此各组分按相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱而达到分离。
凝胶层析常用的凝胶包括：
亲和层析利用生物分子与配基之间专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化。具有这种亲和力的生物分子对包括：酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶 RNA 与互补的 RNA 分子或片段、RNA 与互补的 DNA 分子或片段等。
本页图示亲和层析的四个要素（载体基质、配基、待分离生物分子与洗脱条件），建议对照原图确认各要素的具体名称。
本页图示常用的亲和介质及其专一性配体，建议对照原图核对配体与纯化对象的对应关系。
根据欲分离组分与配基的结合特性，亲和层析可以分为：
本页图示疏水层析与反相层析的基本原理：利用蛋白质表面疏水残基与疏水配基之间的相互作用，在高盐条件下促进吸附，再逐步降低盐浓度洗脱。建议对照原图补充具体洗脱条件。
带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。按使用的支持体不同可分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳等。
颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和大小影响，此外还受到电场强度、溶液 pH 值、离子强度及支持体特性等外界条件的影响。
制备式电泳通常以不含 SDS 的原态 disc-PAGE 进行，以便回收具有活性的蛋白质。
蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色带的位置。
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萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术，两相一般为互不相溶的两个液相，有时也可采用其它流体。按两相组成不同可分为：
双水相系统由两种聚合物或聚合物与盐组成，下表列出常见的配对组合（聚合物 P／聚合物 Q 或盐）：
| 聚合物 P | 聚合物 Q 或盐 |
|---|---|
| 聚丙二醇 | 甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、葡聚糖 |
| 聚乙二醇 | 聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖 |
| 甲基纤维素 | 羟甲基葡聚糖、葡聚糖 |
| 乙基羟乙基纤维素 | 葡聚糖 |
| 羟丙基葡聚糖 | 葡聚糖、聚蔗糖 |
| 聚蔗糖 | 葡聚糖 |
| 聚乙二醇 | 硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸钠、酒石酸钾钠 |
注：源文件为单行粘连文本，本表按「聚合物 P／聚合物 Q 或盐」两列结构推断切分，建议对照原图核对。
| 流体名称 | 临界温度（℃） | 临界压力（MPa） | 临界密度（g/ml） |
|---|---|---|---|
| 乙烷 C2H6 | 32.3 | 4.88 | 0.203 |
| 丙烷 C3H8 | 96.9 | 4.26 | 0.220 |
| 丁烷 C4H10 | 152.0 | 3.80 | 0.228 |
| 戊烷 C5H12 | 296.7 | 3.28 | 0.232 |
| 乙烯 C2H4 | 9.9 | 5.12 | 0.227 |
| 氨 NH3 | 132.4 | 11.28 | 0.236 |
| 二氧化碳 CO2 | 31.1 | 7.38 | 0.46 |
| 二氧化硫 SO2 | 157.6 | 7.88 | 0.525 |
| 水 H2O | 374.3 | 22.11 | 0.326 |
| 笑气 N2O | 36.5 | 7.17 | 0.451 |
| 氟里昂 | 28.8 | 3.90 | 0.578 |
注：源文件数字与名称粘连（如「乙烷C2H632.34.880.203」「氟里昂C28.83.900.578」），本表按列名推断切分，建议对照原图核对。
设计分离纯化工艺的基本要求包括四个方面：
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浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程，在酶的分离纯化中是重要环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用；用硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸水剂吸去水分也可达到浓缩效果。
蒸发浓缩通过加热或减压使部分溶剂汽化蒸发。由于酶在高温下不稳定、容易变性失活，酶液浓缩通常采用真空浓缩，即在一定真空条件下使酶液在 60 ℃ 以下进行浓缩。
在固体酶制剂生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，既是酶分离纯化的一种手段，也为酶的结构与功能研究提供样品，为较高纯度酶的获得和应用创造条件。
酶在结晶之前必须纯化达到一定纯度，通常纯度应在 50% 以上方能结晶；纯度越高越容易结晶。不同酶对结晶时纯度要求不同，酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度。
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