页数：39页文件大小：2.72 MB来源： 酶工程ppt课件
本课件讲述通过人工方法改变酶分子结构以改善其性能的技术。先说明修饰的意义与对反应条件的要求，再逐一讲解金属离子置换、大分子结合、侧链基团、肽链有限水解、氨基酸置换与物理修饰六类方法及其过程，最后归纳修饰后热稳定性、抗原性与半衰期的变化，并介绍酶的定向进化原理与实例。
本章为《酶工程》第四章，主题为酶的分子修饰，讨论如何通过人工方法改变酶分子的结构，从而改变酶的特性与功能。
酶分子修饰的意义：
对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面有足够的了解：
修饰反应应尽可能在酶稳定条件下进行，尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高：
酶分子的修饰方法主要有：
含金属离子的酶举例：α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）、谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+）、过氧化氢酶分子中的铁离子（Fe2+）、酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）、超氧化物歧化酶分子中的铜锌离子（Cu2+、Zn2+）。
除去金属离子后酶往往丧失催化活性；重新加入原有金属离子，活性可恢复或部分恢复；用另一种金属离子置换则呈现不同特性，可能降低或提高活性与稳定性。
金属离子置换修饰的过程：
该方法只适用于分子结构中本来含有金属离子的酶，用于置换的金属离子一般都是二价金属离子。
非共价修饰：使用能与酶非共价相互作用又能有效保护酶的添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既可通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效与外部水相连，从而保护酶的活力。
共价修饰：用可溶性大分子如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等通过共价键连接于酶分子表面，形成一层覆盖层。
大分子共价修饰的过程：
聚乙二醇是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，末端活化后可与酶产生交联，因而广泛用于酶的修饰。
| 酶 | 半衰期 | 相对稳定性 |
|---|---|---|
| 天然 SOD | 6 min | 1 |
| 右旋糖酐-SOD | 7 h | 70 |
| Ficoll（低分子量）-SOD | 14 h | 140 |
| Ficoll（高分子量）-SOD | 24 h | 240 |
| 聚乙二醇-SOD | 35 h | 350 |
该方法可用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶结构、特性和功能的影响，在研究酶活性中心必需基团时经常采用。
酶蛋白的侧链基团指氨基酸残基上的功能团，主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用；侧链基团一旦改变将引起空间构象改变，从而改变酶的特性和功能。
本页图示酶蛋白侧链羧基的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链氨基的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链巯基的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链咪唑基（组氨酸残基）的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链酚羟基（酪氨酸残基）的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链胍基（精氨酸残基）的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
本页图示酶蛋白侧链色氨酸吲哚基的化学修饰反应式，建议对照原图核对所用修饰剂与反应条件。
a、胃蛋白酶原的激活：胃蛋白酶原在酸性条件下切除前体肽段，转变为有活性的胃蛋白酶。建议对照原图确认切除位点与所需 pH 条件。
本页图示胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活过程：在肠激酶或已有胰蛋白酶作用下切除 N 端肽段，构象重排后形成有活性的胰蛋白酶。建议对照原图确认切除的肽段序列与激活条件。
氨基酸或核苷酸的置换修饰可采用化学修饰方法。例如 Bender 等利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但化学修饰法难度大、成本高、专一性差，需逐个修饰，操作复杂，难以工业化生产。
现在常用的方法是定点突变（site directed mutagenesis）：20 世纪 80 年代发展起来的基因操作技术，指在 DNA 序列的某一特定位点上进行碱基改变从而获得突变基因的操作技术，是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。
酶分子定点突变的主要步骤：
通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端 pH 值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶特性和功能的变化情况。
特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下副键发生某些变化和重排。
酶经修饰后的性质变化：
酶分子的改造有两条路线：
本页图示酶的合理设计思路：在已知酶空间结构与催化机制的基础上，有针对性地设计并改造酶分子，以获得预期性质。建议对照原图补充具体设计流程。
理论上蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待开发，这是体外定向进化的基本先决条件。该技术极大拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别能够解决合理设计所不能解决的问题，并在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
在待进化酶基因的 PCR 扩增反应中，利用 Taq DNA 聚合酶不具有 3'→5' 校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法选出所需性质的优化酶（或蛋白质），从而排除其他突变体。
前者由人为引发，后者相当于环境，只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全在人为控制下进行。
DNA 改组（DNA shuffling）又称有性 PCR（sexual PCR），目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过 DNA 改组不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的 2 个或更多已优化性质合为一体。
外显子改组（exon shuffling）类似于 DNA 改组，两者都在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。自然界中不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与 DNA 改组不同，外显子改组靠同一种分子间内含子的同源性带动，而 DNA 改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。
本页图示 DNA 改组的原理流程：将亲本基因酶切成随机片段，经无引物 PCR 使片段互为引物重排延伸，再以重排产物为模板扩增全长基因并导入表达筛选。建议对照原图补充各步骤条件。
| 酶 | 突变性质 | 方法 |
|---|---|---|
| 枯草杆菌蛋白酶 E | 有机相活性／稳定性 | 易错 PCR |
| β-内酰胺酶 | 总活力／底物专一性 | DNA 改组 |
| 枯草杆菌蛋白酶 BPN′ | 稳定性 | 盒式诱变 |
| 对硝基苯酯酶 | 底物专一性／有机相活性 | 易错 PCR／DNA 改组 |
| 胸腺嘧啶核苷激酶 | 底物专一性 | 盒式诱变 |
| β-半乳糖苷酶 | 底物专一性 | DNA 改组 |
| 绿色荧光蛋白 | 荧光 | DNA 改组 |
| 核酶 | 底物专一性 | 易错 PCR／DNA 改组 |
| 天冬氨酸酶 | 活性与稳定性 | 随机／定位诱变 |
| 药物和疫苗 | 活性／专一性／最佳表达 | DNA 改组 |
注：源文件为单行粘连文本，本表按「酶／突变性质／方法」三列结构推断切分，建议对照原图核对。
下载地址：{{downurl}}
{{{a}}}
{{#b}}{{{b}}}
{{/b}} {{/title}} {{#nolog}}登陆注册
{{/nolog}} {{#djsx}}点我刷新
{{/djsx}} {{#gocz}} {{/gocz}} {{#ffqr}} {{/ffqr}}