页数：33页文件大小：4.22 MB来源： 酶工程ppt课件
本课件讲述把水溶性酶变成水不溶性固定化酶的技术。先指出游离酶稳定性差、难以回收和产物纯化困难的不足，回顾固定化酶与固定化细胞的发展历史，再逐一讲解吸附法、包埋法、结合法与交联法的载体、原理与优缺点，最后说明固定化酶的稳定性、最适 pH 与底物特异性变化，及其在 L-氨基酸、高果糖浆生产和酶电极中的应用。
本章为《酶工程》第五章，主题为固定化酶和固定化细胞，讨论如何把水溶性酶转变为水不溶性酶以实现重复使用与连续化生产。
酶应用过程中存在以下不足，引出固定化技术：
固定化技术：水溶性酶 + 水不溶性载体 → 水不溶性酶（固定化酶）。
酶的固定化方法及其操作特征：
固定化酶操作需要注意三方面：
常用固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。优点是操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活、载体廉价易得且可反复使用；缺点是靠物理吸附作用结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，使用受到一定限制。
常用多孔载体有琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。按载体与方法分为两类：
首先被采用包埋法固定的酶有：
体系组成：酶 + N,N-甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、引发剂。
将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用 CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的 Na+ 部分被 Ca2+ 所取代，形成由多价离子交联的离子网络凝胶。
该方法的优点之一是颗粒大小可实时监控。
本页图示脂质体包裹固定化：酶被包埋在磷脂双分子层形成的脂质体囊泡内部，可保护酶并控制底物与产物的进出。建议对照原图补充脂质体组成与制备方法。
戊二醛有两个醛基，都可与酶或蛋白质的游离氨基反应形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。
优点是结合牢固、可长时间使用；缺点是交联反应条件较激烈，酶分子多个基团被交联致使酶活力损失较大，且颗粒较小给使用带来不便。可将交联法与吸附法或包埋法联合使用以取长补短。常用双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。
固定化酶的两种共价方式：
将酶或含酶菌体固定化后，由于受载体等影响，酶的特性可能会有些变化：
世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969 年日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离的氨基酰化酶，用 DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将 L-乙酰氨基酸水解生成 L-氨基酸，用来拆分 DL-乙酰氨基酸，连续生产 L-氨基酸。剩余的 D-乙酰氨基酸经过消旋化生成 DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的 60% 左右。
本页图示 L-丙氨酸连续生产装置：储罐 → 泵 → 固定化酶柱子 → 反应产物 → 离心机分离晶体 L-Ala，剩余 A-D-Ala 进入消旋反应器转化后再循环拆分。建议对照原图核对各单元顺序。
世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用 60～65 ℃ 热处理 15 min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。
本页图示青霉素酰化酶转化流程：固定化青霉素酰化酶柱连续催化水解，产物经分离纯化得到 6-APA 等中间体。建议对照原图补充反应底物、产物与工艺参数。
酶传感器由固定化酶与传感元件两部分组成，其中酶是与适当载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。
酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962 年 Clark 和 Lyons 提出模型，1967 年 Updike 和 Hicks 首先制造出酶电极并用于葡萄糖的定量分析。
较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。
葡萄糖 + 醌 + H2O —（葡萄糖氧化酶）→ 葡萄糖酸 + 氢醌；氢醌 → 醌 + 2H+ + 2e－，由铂（Pt）电极检测电子转移。
葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢，就可了解葡萄糖浓度。
本页图示手掌型葡萄糖（glucose）分析仪，是基于葡萄糖酶电极的便携式检测装置，用于快速测定血糖浓度。建议对照原图补充仪器型号与检测范围。
脲电极：Urea + 2H2O —（脲酶）→ 2NH4+ + 2HCO3－，产生的 2NH4+ 由阳离子电极感应。
此外还有：氨基酸电极、醇电极、尿酸电极、乳酸电极、青霉素电极；亚硝酸离子电极则利用菠菜亚硝酸还原酶产生 NH3。
| 底物 | 酶 | 电极 |
|---|---|---|
| 5′-腺苷酸 | 5′-腺苷酸脱氨酶 | NH4+ |
| 乙醇、醇 | 乙醇脱氢酶 | Pt |
| 过氧化物 | 过氧化氢酶 | Pt（O2） |
| 磷酸葡萄糖 | 硫酸酯酶 + 葡萄糖氧化酶 | Pt（O2） |
| D-氨基酸 | D-氨基酸氧化酶 | NH4+ |
| L-氨基酸 | L-氨基酸氧化酶 | NH3 |
| 蔗糖 | 蔗糖酶 + 葡萄糖氧化酶 | Pt（H2O2） |
| 琥珀酸 | 琥珀酸脱氢酶 | Pt（O2） |
| 硫酸酯 | 芳基硫酸酯酶 | Pt |
| 硫氰酸 | 硫氰酸酶 | CN－ |
| 硝酸盐 | 硝酸盐还原酶／亚硝酸盐还原酶 | NH4+ |
| 亚硝酸盐 | 亚硝酸盐还原酶 | NH3（气体） |
| 草酸 | 草酸脱羧酶 | CO2（气体） |
| 青霉素 | 青霉素酶 | pH |
| 乳酸 | 乳酸脱氢酶；细胞色素 b | Pt，Fe(CN)64－ |
| — | L-氨基酸脱羧酶 | CO2 |
| L-精氨酸 | 精氨酸酶 | NH4+ |
| L-天冬酰胺 | 天冬酰胺酶 | NH4+ |
注：源文件为整段粘连文本，本表按「底物／酶／电极」三列结构推断切分；其中「磷酸葡萄」据上下文补为「磷酸葡萄糖」，「L-氨基酸脱羧酶」一行的底物原文缺失以「—」占位，建议对照原图核对。
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