页数：28页文件大小：1.10 MB来源： 细胞生物学ppt课件
本课件讲解细胞及其组分的分离纯化与分析方法，包括流式细胞分选仪的直方图、二维图与等高图显示及单细胞悬液制备，差速、速度区带与等密度三类离心法的比较，纸层析与柱层析，以及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与双向电泳的分辨率差异。
第三节 细胞及其组分的分离纯化和分析
本节介绍流式细胞分选技术、细胞组分的分级分离（差速离心、速度区带离心、等密度离心）、层析技术以及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与双向电泳。
流式细胞分选仪
本页以示意图展示流式细胞分选仪的整体构成，包括液流系统、光学系统与分选系统。
③二维等高图：等高图上每一条连续曲线代表具有相同细胞数的细胞群，即等高；曲线层次越高，代表的细胞数越多。
（二）样品的制备 1. 制备单个细胞悬液：分离不同类型的细胞后，用蛋白水解酶（胰蛋白酶、胶原酶）消化细胞间结合物质，或用金属离子螯合剂（乙二胺四乙酸 EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的 Ca²⁺，然后用轻微的机械方法即可制备成单个细胞悬液。
流式细胞分选仪
本页以示意图展示流式细胞分选的分选过程：含目标细胞的液滴被充电后在电场中偏转，分别落入不同收集管。
二、细胞组分的分级分离
分级分离按原理分为两类：利用颗粒大小不同（差速离心法、速度区带离心法）与利用颗粒密度不同（等密度离心法）。
分级分离原理：依据颗粒大小或密度的不同选择相应的离心方法。
| 分离依据 | 方法 | 适用对象 |
|---|---|---|
| 颗粒大小不同 | 差速离心法 | 大小、形状差异显著的组分，按沉降速度不同分离 |
| 颗粒大小不同 | 速度区带离心法 | 大小差别不显著的组分 |
| 颗粒密度不同 | 等密度离心法 | 大小、形态相似而密度不同的组分 |
1、差速离心法：用于分离大小、形状不同显著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离。
2、速度区带离心法：用于分离大小差别不显著的组分。
原文写作“不保留复制”，按其论证的 DNA 复制方式修正为“半保留复制”。
三、层析
本部分介绍纸层析与柱层析，其中柱层析常用离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析三种方法。
1、纸层析
纸层析以滤纸作为支持介质，利用不同物质在固定相与流动相之间分配系数的差异实现分离。
2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。
柱层析的常用方法：
四、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：电泳（electrophoresis）是指在含有蛋白质分子的溶液里加上电场，蛋白质就会按照它的净电荷、大小和形状，以一定的速度在电场中移动，这一技术叫电泳。
聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺＋N,N′-亚甲双丙烯酰胺聚合而成。
五、双向电泳 目的：单向 SDS-PAGE 电泳分辨力差，只能分开 50 种左右的蛋白；双向电泳可分辨 1000 种以上的蛋白质，一般为 2000～15000 种。
步骤：1、等电聚焦电泳：按蛋白质等电点的不同在第一向进行分离。
步骤：2、在垂直于第一次电泳的方向上进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行第二向分离。
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