第1页：实验八 亲和层析分离纯化目标蛋白
实验八 亲和层析分离纯化目标蛋白
第2页：实验目的
- 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分）。
- 掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和方法（第二部分）。
第3页：第一部分 GST亲和层析
第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白
第4页：亲和层析原理
亲和层析依据生物大分子与配体特异、非共价、可逆结合的特性进行分离，常见的配对包括：
- 酶－底物。
- 酶－底物类似物（酶的竞争性抑制剂）。
- 抗体－抗原。
- 激素－受体。
- 外源凝集素－多糖、糖蛋白、细胞表面受体。
- 核酸－互补核苷酸序列（Oligo-dT）。
第5页：亲和层析流程
亲和层析原理：将配体共价偶联于惰性载体上装柱，混合样品流过时只有能与配体特异结合的目标蛋白被滞留，杂蛋白随流动相流出，再改变条件（如加入游离配体）将目标蛋白特异洗脱，从而实现高选择性纯化。
第6页：GST亲合层析
- 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kD）与谷胱甘肽GSH特异结合。
- GSH作为配体共价结合在葡聚糖上（Sepharose 4B）。
- GST融合目标蛋白。
- 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合。
- 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白。
第7页：GSH-Sepharose 4B 填料
GSH-Sepharose 4B：以琼脂糖凝胶Sepharose 4B为载体，表面共价偶联还原型谷胱甘肽（GSH）配基，用于特异吸附GST及GST融合蛋白。
第8页：GSH-Sepharose 4B 装柱
GSH-Sepharose 4B装柱：将填料加入层析柱中使其自然沉降形成均匀柱床，操作中始终保持柱内液面高于填料，避免柱床干裂或进入气泡。
第9页：GSH与GST结合示意
GSH-Sepharose 4B上的谷胱甘肽与GST标签特异性结合，使GST融合蛋白被固定在凝胶上，其他杂蛋白被洗去后，再用游离的还原型GSH竞争洗脱即可获得纯化的融合蛋白。
第10页：实验步骤
实验步骤：一、装GST柱；二、纯化目的蛋白。
第11页：装GST柱
- 清洗和装好层析柱，封闭出口。
- 加入2mL PBS。
- 取1mL GSH-Sepharose 4B填料，加入柱子中。
- 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于填料。
第12页：纯化目的蛋白操作
- 用5mL PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。
- 将混合蛋白质溶液加到柱子中。
- 用5mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。
- 加入1mL洗脱液。
- 用1.5mL离心管收集洗脱液，每管收集0.2mL（约4滴）。
- PBS缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。
- 将第2管和第3管用于目的蛋白的检测。
第13页：待纯化样品制备
- 待纯化蛋白
- GST标记的纤维素酶。
- 来源
- 重组大肠杆菌。
- 提取方法
- 超声波破碎细胞释放GST-纤维素酶；条件为超声处理3秒、间歇5秒，共15分钟。
- 处理
- 4000rpm离心5分钟，取上清（混合蛋白质溶液）上柱。
第14页：SDS-PAGE样品制备
- 1号样：过柱前的蛋白溶液25μL，加5μL 5×上样缓冲液。
- 2号样：洗脱的蛋白溶液（2号管）25μL，加5μL 5×上样缓冲液。
- 3号样：洗脱的蛋白溶液（3号管）25μL，加5μL 5×上样缓冲液。
- 点样前沸水中加热3~5min。
第15页：第二部分 SDS-PAGE检测
第二部分 SDS-PAGE检测目标蛋白
第16页：第二部分实验目的
- 掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理和方法。
- 掌握垂直板电泳的操作方法。
第17页：SDS-PAGE原理
- 蛋白质与SDS按1︰1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
- 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。
- 在15~200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW＝K－bm。
第18页：
本页源文件未提取到文字内容，仅有图片（位于第17页SDS-PAGE原理与第19页不连续系统说明之间）。建议对照原课件图片补充本页要点说明。
第19页：不连续系统与连续系统
- 不连续系统
- 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度不连续，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。
- 连续系统
- 电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，只有电荷效应与分子筛效应。
第20页：浓缩效应
三个不连续性构成浓缩效应：
- 凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）。
- 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-低、比Gly高。
- 电位梯度不连续性：快离子（Cl-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，两者之间形成稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。
第21页：制胶操作
- 洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。
- 制作12%分离胶。按下表所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间。
- 用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。
- 倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。
- 水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。
- 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
- 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。
第22页：12%分离胶配方
12%分离胶配制| 试剂名称 | 加入量 |
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| ddH2O | 2.5mL |
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| 30% Acr-Bis（29:1） | 3.0mL |
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| 1.5M Tris-HCl（pH8.8） | 2.0mL |
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| 10% SDS | 75μL |
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| TEMED（加速剂） | 10μL |
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| 10% APS（催化剂，最后加） | 75μL |
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| 总体积 | 7.5mL |
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第23页：5%浓缩胶配方
5%浓缩胶配制| 试剂名称 | 加入量 |
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| ddH2O | 1.7mL |
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| 30% Acr-Bis（29:1） | 0.43mL |
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| 1M Tris-HCl（pH6.8） | 0.31mL |
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| 10% SDS | 25μL |
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| TEMED | 10μL |
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| 10% AP（最后加） | 25μL |
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| 总体积 | 2.5mL |
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第24页：电泳与染色脱色
- 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。
- 点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）：每个点样孔点30μL样品，每板胶点5μL Marker；加样前样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合。
- 80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后将电压调节到120V。
- 溴酚蓝接近胶底部时关闭电源，电泳结束。
- 撬开玻璃板，将凝胶做好标记，放在塑料盒内，加入染色液，染色30min左右。
- 染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。
第25页：实验结果分析
实验结果分析：绘制标准曲线 log MW＝K－bm。
- 相对迁移率
- 相对迁移率＝蛋白质区带中心至分离胶上沿距离／溴酚蓝至分离胶上沿距离。
- 作图方法
- 以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标、相对迁移率作横坐标作标准曲线，计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。
第26页：低分子量标准蛋白
低分子量标准蛋白（Marker）| 蛋白质名称 | 分子量（MW） |
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| 兔磷酸化酶B | 97400 |
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| 牛血清白蛋白 | 66200 |
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| 兔肌动蛋白 | 43000 |
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| 牛碳酸酐酶 | 31000 |
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| 胰蛋白酶抑制剂 | 20100 |
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| 鸡蛋清溶菌酶 | 14400 |
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第27页：实验试剂
- 30%丙烯酰胺（Acr）。
- 10% SDS。
- 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液。
- 1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液。
- 10%过硫酸铵（AP）（现配现用）。
- TEMED（四甲基乙二胺）。
- 2×样品缓冲液。
- 10×电极缓冲液母液（pH8.3）。
- 染色液。
第28页：
本页源文件未提取到文字内容，仅有图片（位于第27页实验试剂之后、结束页之前）。建议对照原课件图片补充本页要点说明。
第29页：结束页
End
