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01-2 实验一 酶的底物专一性.docx

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本指导为实验一配套讲义,完整列出实验目的与酶专一性原理,说明淀粉、蔗糖结构与Benedict反应显色依据,给出淀粉酶溶液、蔗糖酶溶液、Benedict试剂的配制方法与三组试管操作方法,并附酶的激活剂及抑制剂的目的、原理与操作。

实验一讲义首页,说明实验目的、酶专一性四种分型、淀粉与蔗糖结构及Benedict反应原理
实验一讲义试剂与操作页,列出淀粉蔗糖溶液、Benedict试剂配方、器材清单与检查试剂及淀粉酶专一性加样表
实验一讲义操作页,列出蔗糖酶专一性加样表、四个思考题及酶的激活剂与抑制剂的目的原理与试剂
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第1页:实验一目的与原理

一、实验目的

  • 了解酶的专一性。
  • 掌握检查酶的专一性的原理和方法。
  • 学会排除干扰因素,设计酶学实验。

二、实验原理

1 酶的专一性
一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用,如淀粉酶只能催化淀粉水解,对蔗糖的水解无催化作用。分为键专一性(如脂酶、核酶)、基团专一性(族专一性,如α-、β-葡萄糖苷酶、转移酶)、绝对专一性(如某些核酸工具酶)、立体异构专一性(旋光异构与几何异构专一性)。
2 淀粉和蔗糖的结构
淀粉分直链淀粉与支链淀粉:直链淀粉由200~300个α-葡萄糖以α-1,4糖苷键相连成一直链;支链淀粉兼有α-1,4与α-1,6糖苷键并形成分支。蔗糖是由α-葡萄糖和β-果糖以α-1,2糖苷键相连而成的双糖。
3 Benedict反应
Benedict试剂为碱性硫酸铜溶液,与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还原反应生成氧化亚铜(Cu2O)砖红色沉淀;淀粉和蔗糖都不反应,其水解产物葡萄糖可发生该反应,故以颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶的水解作用。

本实验分别以唾液淀粉酶(内含淀粉酶及少量麦芽糖酶)、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的催化作用,观察两种酶的底物专一性。

三、试剂

  • 干酵母、可溶性淀粉或食用淀粉、蔗糖、NaCl、柠檬酸钠、无水碳酸钠、硫酸铜。
  • 新鲜淀粉酶溶液:唾液1mL倒入10mL量筒中(不包括泡沫),用蒸馏水稀释到70mL,静置10分钟后去掉上层泡沫和下层沉淀。
  • 蔗糖酶溶液:干酵母2.5g置研钵中,加半勺石英沙及蒸馏水少许(约4mL),用力研磨10分钟,转入50mL离心管,另用25mL蒸馏水洗涤研钵并合并,摇匀静置5分钟,4000r/min离心5分钟,小心取出上清液(含蔗糖酶)备用。

第2页:试剂器材与操作表

  • 0.5%淀粉溶液(含0.3%NaCl):可溶性淀粉或食用淀粉新鲜配置,先清水浸泡、离心,沉淀如此清洗三次再配置。
  • 2%蔗糖溶液:蔗糖要分析纯。
  • Benedict试剂:85g柠檬酸钠(Na3C6H3O7·11H2O)加50g无水碳酸钠溶于400mL水;8.5g硫酸铜溶于50mL热水中;将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液,边加边摇,最后定容至500mL,如有沉淀可过滤。本试剂可长期使用,放置过久出现沉淀时可用上清液。
  • 器材:试管架、试管10只、烧杯(100mL×2,200mL×1)、量筒(10mL×1,100mL×1)、玻璃漏斗、棉花、研钵、石英沙、500mL容量瓶。

四、操作方法:1、检查试剂——取3支试管按下表操作。

检查试剂
试剂试管1试管2试管3
0.5%淀粉溶液(mL)——3
2%蔗糖溶液(mL)—3—
蒸馏水(mL)3——
Benedict试剂(mL)222
处理摇匀,沸水煮沸2分钟摇匀,沸水煮沸2分钟摇匀,沸水煮沸2分钟
淀粉酶的专一性
试剂试管1试管2试管3
稀释的唾液淀粉酶(mL)111
0.5%淀粉溶液(mL)——3
2%蔗糖溶液(mL)—3—
蒸馏水(mL)3——
保温摇匀,37℃保温45分钟摇匀,37℃保温45分钟摇匀,37℃保温45分钟
Benedict试剂(mL)222

本表保温时间讲义记为45分钟,课件页记为30分钟,两者均按原样保留,实验时以课堂要求为准。

第3页:蔗糖酶专一性与思考题

蔗糖酶的专一性
试剂试管1试管2试管3
蔗糖酶溶液(mL)111
0.5%淀粉溶液(mL)——3
2%蔗糖溶液(mL)—3—
蒸馏水(mL)3——
保温摇匀,37℃保温15分钟摇匀,37℃保温15分钟摇匀,37℃保温15分钟
Benedict试剂(mL)222
处理沸水煮沸2分钟,观察记录结果并分析原因沸水煮沸2分钟,观察记录结果并分析原因沸水煮沸2分钟,观察记录结果并分析原因

思考题

  1. 观察酶的专一性为什么要设计这3组实验?每组各有什么意义?每组中蒸馏水分别起什么作用?
  2. 将酶煮沸10分钟,重做2、3的操作会有什么结果?
  3. 请回忆淀粉类型、结构及蔗糖的结构式。

附:酶的激活剂及抑制剂

目的和要求
了解酶促反应的激活与抑制,学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。
原理
能使酶活性增加的物质称激活剂,使活性降低的称抑制剂。氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂,硫酸铜为其抑制剂;激活剂与抑制剂不是绝对的,氯化钠达到1/3饱和度时即可抑制唾液淀粉酶活性。
  • 试剂:1%淀粉溶液、稀释100~200倍的新鲜唾液、1%氯化钠溶液、0.1%硫酸铜溶液。
  • 碘化钾—碘溶液:碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中,使用前需稀释10倍。

第4页:激活剂与抑制剂操作

酶的激活剂及抑制剂操作
试剂试管1试管2试管3
1%氯化钠溶液(mL)1——
0.1%硫酸铜溶液(mL)—1—
蒸馏水(mL)——1
0.1%淀粉溶液(mL)333
稀释唾液(mL)111
保温摇匀,37℃保温15分钟摇匀,37℃保温15分钟摇匀,37℃保温15分钟
碘化钾—碘溶液2滴2滴2滴
观察摇匀后记录结果并分析原因摇匀后记录结果并分析原因摇匀后记录结果并分析原因

思考题

  1. 激活剂可以分为哪几类?本实验中氯化钠是属于其中哪一类?
  2. 抑制剂与变性剂有何不同?试举例说明。
  3. 酶反应的抑制作用有哪些类型?根据什么划分的?它们都有什么特点?
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