09-1 实验九 Western_Blot鉴定目的蛋白.pptx

第1页：Western Blot鉴定目的蛋白

实验九 Western Blot鉴定目的蛋白

第2页：Western Blot原理四步

实验原理：Western Blot由四步组成——

1. SDS-PAGE：按分子量分离蛋白质。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白转移至固相膜上。
3. 结合一抗和二抗：以特异性抗体识别靶蛋白。
4. 显色：通过酶促显色反应显示靶蛋白位置。

第3页：SDS-PAGE原理

• 蛋白质与SDS按1︰1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。
• 在15~200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW＝K－bm。

第4页：预染Marker条带

预染Marker自带颜色，可作为电泳与转膜的直观指示。

第5页：Western Blotting 流程

Western Blotting：先以SDS-PAGE按分子量分离蛋白质，再将凝胶中的蛋白条带电转移至固相膜上，随后用特异性一抗与酶标二抗依次孵育，最后通过显色或化学发光显示靶蛋白的位置与含量。

第6页：转膜与抗体结合示意

转膜时将凝胶与固相膜（NC膜或PVDF膜）紧贴，两侧各垫滤纸，在电场作用下带负电的蛋白质由凝胶迁移并吸附在膜表面，形成与凝胶一致的蛋白印迹，供后续抗体孵育与显色。

第7页：DAB显色原理

显色原理：二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物。

第8页：样品和抗体

• 样品：大肠杆菌可溶蛋白（含GST-纤维素酶融合蛋白）。
• 一抗：鼠抗GST抗体。
• 二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。

第9页：实验步骤

实验步骤：SDS-PAGE → Western blotting转膜 → 杂交（封闭、一抗、二抗）→ 显色。

第10页：SDS-PAGE操作

1. 洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽（每班做4版胶，用2个电泳槽）。
2. 制作12%分离胶。按下表所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间。
3. 用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。
4. 配好浓缩胶（10mL），轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。

• 水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。
• 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
• 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。

第11页：12%分离胶配方

第12页：5%浓缩胶配方

第13页：电泳与切胶

1. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。
2. 点样（待测蛋白样，加入样品缓冲液）：每个点样孔点30μL样品，每板胶点5μL预染Marker（预染Marker是有颜色的，可以作为电泳和转膜的指示）；加样前样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合。
3. 80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，电泳2h。
4. 溴酚蓝接近胶底部时关闭电源，电泳结束。
5. 撬开玻璃板，根据预染Marker和溴酚蓝的位置切去浓缩胶和多余的分离胶（不要染色）。

第14页：Western blotting转膜

1. 用尺量出胶的长度和宽度。
2. 用裁纸刀裁出12张与胶大小一样的滤纸和1张同样大小的硝酸纤维素膜（NC膜）。
3. 加10mL转膜缓冲液到培养皿中，将凝胶、NC膜、滤纸浸泡约5min。
4. 将凝胶、NC膜、滤纸按照图示安装好。
5. 20V电转移20~30分钟。

Western blotting转膜操作过程须戴手套。

第15页：

本页源文件未提取到文字内容，仅有图片（位于第14页转膜操作与第16页杂交操作之间）。建议对照原课件图片补充本页要点说明。

第16页：封闭与一抗二抗杂交

1. 取出NC膜，放在一个干净的容器内，加入10mL封闭液，平缓摇动30min（封闭膜上非特异结合位点）。
2. 回收封闭液，用10mL TTBS洗膜5min，重复3次（洗去过量的奶粉）。
3. 加入一抗溶液（10mL），摇动30min（与抗原结合）。
4. 回收一抗溶液，10mL TTBS洗膜5min，重复3次（一抗可以重复使用）。
5. 加入二抗溶液（10mL），摇动30min（与一抗结合）。
6. 回收二抗溶液，10mL TTBS洗膜5min，重复3次（二抗可重复使用）。

杂交：一抗和二抗溶液必须回收！！

第17页：显色操作

显色

1. 倒掉TTBS，加入显色液，摇动显色3~5min。
2. 倒掉显色液，用蒸馏水漂洗3~5min，晾干。

第18页：杂交结果图

杂交结果：9d、14d、19d、24d四个样品经显色后均在与预染Marker 109.7kD对应的位置出现GhCESA1杂交条带，Marker条带自上而下为250、130、95、72、55、36、28kD，说明目的蛋白在四个时期均有表达。

第19页：实验材料和试剂

实验材料和试剂：分为SDS-PAGE试剂与Western Blotting试剂两部分。

第20页：SDS-PAGE试剂

1. 30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺、1g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，溶于60mL去离子水中，搅拌加热溶解后补水至终体积100mL；用滤纸过滤后避光4℃保存。
2. 10% AP（过硫酸铵）：0.1g AP溶于1mL蒸馏水，存放一周以后会失效。
3. 10% SDS：5g SDS加水50mL。

第21页：SDS-PAGE缓冲液与上样缓冲液

1. 1.5mol/L Tris（pH8.8）：18.15g Tris溶于80mL去离子水中，调pH至8.8，定容至100mL。
2. 1.5mol/L Tris（pH6.8）：18.15g Tris碱溶于80mL去离子水中，调pH至6.8，定容至100mL。
3. 5×SDS loading buffer：1mol/L Tris-HCl（pH6.8）12.5mL、SDS 5g、溴酚蓝0.25g、甘油25mL、H₂O 12.5mL；使用前按上述配方配50mL总量，分装小管，每1mL buffer加50μL巯基乙醇。

第22页：转膜与TBS缓冲液

1. 转膜缓冲液：Tris 3.0g、甘氨酸14.4g、3.7% SDS 10mL、甲醇200mL，加水至1L。
2. 10×TBS缓冲液：Tris 12.1g、NaCl 87.7g溶于800mL单蒸水，调pH至8.0，加水至1L。
3. TTBS缓冲液：100mL 1×TBS缓冲液中加入50μL Tween20。

第23页：封闭液与DAB显色液

1. 封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mL TTBS中。
2. DAB/NiCl显色液：100mmol/L Tris-HCl（pH7.5）10mL、DAB储存液（40mg/mL）200μL、NiCl溶液（80mg/mL）50μL、30% H₂O₂ 30μL。

第24页：一抗与二抗稀释

1. 一抗（鼠抗GST）按1︰1000稀释：在15mL TTBS中加入15μL抗体。
2. 二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体）按照1︰5000稀释：15mL TTBS中加入3μL抗体。