04-2 实验四 植物DNA的提取.docx

第1页：核酸提取基本原理

实验四 植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法，采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA并进行纯度分析。

二、实验原理 1、核酸提取的基本原理

核酸在生物体中常与蛋白质结合成核蛋白，DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质及核仁；制备时通过研磨破坏细胞壁和细胞膜释放核蛋白。在浓氯化钠溶液（1~2mol／L）中DNA核蛋白溶解度大而RNA核蛋白溶解度小，在稀氯化钠溶液（0.14mol／L）中则相反，据此可分别抽提。

分离得到核蛋白后需除去蛋白等杂质，常用方法有三种：

1. 用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液使其乳化，离心除去变性蛋白质，蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间而DNA溶于上层水相；用两倍体积无水乙醇沉淀DNA钠盐，若用酸性乙醇或冰乙酸沉淀则得到游离的DNA。
2. 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中直接提取出DNA。
3. 用苯酚处理，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后停留在酚层内，吸出上层水相加两倍体积无水乙醇得白色纤维状DNA沉淀。

• 为彻底除去混杂的RNA，可用RNA酶处理；脂肪物质和大部分多糖在盐溶液分离核蛋白与乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
• 破坏DNA完整结构的因素：①化学因素，pH4.0~11.0以外会使核酸变性降解，应避免过酸过碱；②物理因素，强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂；③酶的作用，核酸酶在细胞壁或膜破坏时被释放会降解DNA，须用变性剂与抑制剂（柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、EDTA-Na等）使之失活，操作最好在0℃左右进行；SDS和苯酚作为蛋白变性剂同时可使核酸酶失活。

第2页：CTAB法与SDS法原理及浓度测定

2、CTAB法和SDS法的提取原理

CTAB法

CTAB是阳离子型去污剂，能使蛋白质变性并与核酸形成核酸-CTAB复合物，该复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度后通过超速离心可选择性沉淀核酸并与多糖等杂质分开，再用70~75%乙醇浸泡脱去CTAB。提取时先将新鲜叶片在液氮中研磨破碎细胞，加入CTAB分离缓冲液溶解DNA，再经氯仿－异戊醇抽提除蛋白，最后用异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

SDS法

先将新鲜叶片在液氮中研磨以机械力破碎细胞壁，加入SDS使细胞膜破裂并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开；加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

定磷法

将样品中的核酸用强酸消化成无机磷，再用定磷试剂（酸性钼酸铵溶液）滴定；钼酸铵与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，被抗坏血酸等还原剂还原成蓝色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

紫外光吸收法

核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm；1μg/mL DNA溶液A₂₆₀＝0.020，1μg/mL RNA溶液或单链DNA的A₂₆₀＝0.022~0.024；1个A₂₆₀相当于50μg/mL DNA、40μg/mL RNA。蛋白质最大吸收在280nm，多糖在230nm；纯DNA的A₂₆₀/A₂₈₀约1.8，纯RNA约2.0。

三、试剂和器材

• 1M Tris-Cl（pH8.0）：Tris 121.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0后定容至1000mL。
• CTAB分离缓冲液：2g CTAB，8.18g NaCl，0.74g EDTA·Na₂·2H₂O，10mL 1mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。
• 洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。
• TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH7.4），1mmol/L EDTA。
• 氯仿︰异戊醇＝24︰1。
• 液氮、研钵、恒温水浴（37~100℃）、离心机、离心管。

四、操作方法

1. 将10mL CTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，置于65℃水浴中预热。
2. 称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
3. 取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

第3页：操作步骤与思考题

1. 样品于65℃保温30分钟，每5~10分钟混匀一次。
2. 加等体积（10mL）氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。
3. 室温下4000r/min离心10分钟。
4. 用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀使DNA析出；若看不到云雾状DNA，样品可在冰浴中放置数小时甚至过夜。
5. 收集DNA：若呈云雾状析出，用玻璃棒轻轻转动缠起DNA，转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）；若看不到云雾状DNA，可4000r/min离心5分钟，倒掉上清，在松散沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动洗涤10分钟，再离心倒掉上清，让DNA沉淀自然干燥20分钟。
6. 用玻璃棒缠出DNA，室温下自然干燥20分钟。
7. 将自然干燥的DNA溶于1mL TE缓冲液中，-20℃保存备用。
8. 取100μL稀释20倍，测定A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₃₀，或作出200~400nm吸收波谱并计算浓度和得率。
9. 取5~10μL DNA溶液做0.7%琼脂糖电泳检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5μL做限制性酶切。
10. 注意：所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1. CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？
2. 吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？