03-2 实验三 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法.docx

第1页：层析原理与实验目的

实验四 Dansyl—氨基酸的聚酰胺薄膜层析法

实验目的

1. 学习聚酰胺薄膜层析法的原理。
2. 学习利用Dansyl—氨基酸分析蛋白质N末端氨基酸及蛋白质组成的原理。
3. 掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。

实验原理

• 聚酰胺是一类化学纤维原料，又称锦纶或尼龙，对许多极性化合物有吸附作用，可用于柱层析、薄层层析及薄膜层析；聚酰胺薄膜由锦纶涂布于涤纶片上形成多孔薄膜。
• 聚酰胺的—C＝O基及—NH基可与被分离物质形成氢键，故能吸附酸类、酚类、醌类、硝基及胺基化合物等；展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，经吸附与解吸附过程按一定次序分开。
• 与纸层析及纸电泳相比，该方法灵敏度高、分辨力强、速度快、操作方便，除氨基酸衍生物外还可用于碱基、核苷酸、核苷、酚类、硝基化合物、杂环化合物、抗菌素、磺胺、合成染料等十几类化合物。
• 荧光试剂Dansyl—Cl（二甲基氨基萘磺酰氯）与氨基酸结合成带荧光的Dansyl—氨基酸，酸性条件下可被乙酸乙酯萃取，层析后斑点集中，10^-9~10^-10克分子即可检识；用作蛋白质末端基分析比DNP氨基酸纸层析法灵敏度高100倍，用于氨基酸组成微量分析比茚三酮显色法高10多倍。
• Dansyl—Cl衍生物相当稳定，在5.7N盐酸中105℃加热22小时，除Dansyl—色氨酸全部被破坏以及Dansyl—

第2页：试剂和器材

• 脯氨酸（77%）、丝氨酸（35%）、甘氨酸（18%）、丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余均很少破坏。

一、试剂

DNS—Cl丙酮溶液

称取黄色DNS—Cl粉末配制2.5毫克／毫升的丙酮（分析纯）溶液，贮于棕色瓶中，冰箱保存，一个月内稳定。

样品

纯蛋白质。

0.2M碳酸氢钠溶液

用于DNS化反应的弱碱性介质。

5.7N重蒸盐酸溶液或6N盐酸溶液

用于DNS—蛋白的酸水解。

1N盐酸溶液

用于酸化DNS化氨基酸至pH2~3。

苯、冰乙酸、乙酸乙酯、甲醇

展层与萃取用有机溶剂。

浓氨水（25—28%）

薄膜清洗用。

0.05M磷酸三钠溶液

展层溶剂系统组分。

各种层析纯氨基酸

标准氨基酸DNS化用。

二、器材

• 聚酰胺薄膜（上海试剂四厂、浙江黄岩化学分析材料厂等），可用丙酮与浓氨水（9︰1）或丙酮与90%甲酸（9︰1）浸泡6小时洗涤，甲醇洗后晾干反复使用。
• 自制小钟罩（或小干燥器）：取500毫升试剂瓶或盐水瓶切去底部，塞上橡皮塞或磨口玻璃塞。
• 小培养皿、毛细管、紫外分析灯、水解管（硬质玻璃）、真空干燥器、110℃以上烘箱、磨口试管（5毫升）、微量注射器（50微升）、冰箱、烧杯（5毫升）、照相底片圈（用1N氢氧化钠溶液煮过）、长头滴管、煤气灯。

操作方法一、Dansyl—氨基酸的聚酰胺层析用于测定蛋白质N末端：1．蛋白质样品的Dansyl化——取纯蛋白质样品0.7~2.0毫克溶于0.5毫升水中，加入等体积DNS—Cl丙酮溶液（2.5毫克／毫升），用三乙胺调到

第3页：N末端测定操作流程

1. pH9.0~9.1，混匀塞好，于40℃烘箱中DNS化反应1~2小时，或室温放置过夜；反应后于真空干燥器中抽去丙酮（或60℃水浴蒸去丙酮），待下步酸水解。
2. 2．DNS—蛋白的酸水解：加入0.5毫升5.7N盐酸溶解，转移到硬质玻璃水解管中，火焰封管，110℃水解18~22小时；敲去封口玻璃，移出水解液，抽去盐酸至干，蛋白质全部水解为氨基酸，只有N末端氨基酸连有DNS基；加0.5毫升水溶解，用1毫升乙酸乙酯萃取2~3次，合并萃取液蒸去乙酸乙酯，加0.1毫升丙酮溶解待用。
3. 3．标准氨基酸的DNS化：称取2.3微克分子层析纯氨基酸（0.20~0.48毫克）溶于0.5毫升0.2M碳酸氢钠溶液中，加0.5毫升DNS—Cl丙酮溶液，同法反应并蒸去丙酮；用1N盐酸酸化到pH2~3，乙酸乙酯萃取2~3次（每次1毫升），合并萃取液抽干，冰箱保存待用。
4. 4．聚酰胺薄膜的裁剪：剪成7厘米×7厘米，距边0.5厘米处画基线，基线上画点样位置；双向层析按此距离画交叉十字。
5. 5．点样：DNS—标准氨基酸与蛋白质水解液分别用毛细管点样，斑点直径不超过2毫米。
6. 6．展层：薄膜光面向外、聚酰胺面向内，箍以尼龙条圈或照相底片圈，置于小干燥器内盛有层析溶剂的小培养皿上，展层15~20分钟，取出吹干。
7. 展层溶剂系统：①甲酸（88%）︰水＝1.5︰100（V/V）；②苯︰冰乙酸＝9︰1（V/V）；③乙酸乙酯︰甲醇︰冰乙酸＝20︰1︰1（V/V/V）；④0.05M磷酸三钠溶液︰乙醇＝3︰1（V/V）。测定末端基一般单向展层即可，用甲酸—水系统；双向层析多以②③④做第Ⅰ向、①做第Ⅱ向；为分开NH₃、谷、天门冬、苏、丝、丙的DNS衍生物采用②＋③，为分开精、赖、组的DNS衍生物选用④。
8. 7．检测：于紫外检测灯下观察，DNS—氨基酸显黄色，DNS—Cl的水解产物DNS—OH呈绿色荧光，易于区分。

第4页：氨基酸组成分析与图谱

二、蛋白质氨基酸组分的DNS分析

1. 蛋白质样品的酸水解：取1~5毫微克分子蛋白质样品酸水解，方法同操作一之2，蛋白质全部水解为氨基酸。
2. 氨基酸水解液的DNS化：水解液抽干后加0.5毫升0.2M碳酸氢钠溶液，再加等体积DNS—Cl丙酮溶液进行DNS化反应；反应后用1N盐酸酸化至pH2~3，乙酸乙酯萃取2~3次，合并萃取液抽干，加0.1毫升丙酮溶解待用。
3. 标准氨基酸DNS化、薄膜裁剪、点样、展层、检测：均与测定N末端的操作相同。

检测时还可参照标准DNS-氨基酸层析图谱：

标准DNS-氨基酸层析图谱（左图）

1色氨酸，2 bis-赖氨酸，3 bis-酪氨酸，4 bis-组氨酸，5半胱氨酸，6苯丙氨酸，7亮氨酸，8异亮氨酸，9 DNS—OH，10蛋氨酸，11缬氨酸，12脯氨酸，13天门冬氨酸，14谷氨酸，15甘氨酸，16丙氨酸，17 NH₃，18丝氨酸，19苏氨酸，20组氨酸，21精氨酸，22 ε-赖氨酸。

碱性DNS—氨基酸层析图谱（右图）

1精氨酸，2 DNS—OH，3组氨酸，4 ε-赖氨酸。

思考题

1. 测定蛋白质的N末端基与测定蛋白质的氨基酸组成成分的操作步骤有何不同？为什么？
2. 为什么聚酰胺薄膜可以用来分析氨基酸类、核苷及核苷酸类、酚类、抗菌素、磺胺等多种化合物？