07-1 实验七 SDS-PAGE测蛋白分子量.pptx

第1页：实验七 SDS-PAGE测蛋白分子量

SDS-PAGE测蛋白分子量

第2页：实验目的

• 掌握SDS-PAGE检测蛋白分子量原理和方法。
• 掌握垂直板电泳的操作方法。

第3页：制胶与装槽操作

1. 洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。
2. 制作12%分离胶。按下表所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间，高度约为玻璃板高度的一半。
3. 用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约20min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。
4. 配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约25分钟。

• 水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。
• 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
• 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。

第4页：12%分离胶配方

分离胶的高度为整个凝胶高度的一半。

第5页：5%浓缩胶配方

第6页：电泳、染色与脱色

1. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。
2. 制样：待测蛋白40μL＋蓝色的样品缓冲液15μL，在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合。
3. 点样：点样孔分别点30μL、15μL和10μL样品，每板胶点20μL Marker（老师准备）。
4. 80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，继续电泳；溴酚蓝接近胶底部时关闭电源，电泳结束。
5. 撬开玻璃板，将凝胶做好标记，放在塑料盒内，加入染色液，染色30min左右（染色液需回收，可反复使用）。
6. 染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色（高火微波炉中煮5分钟）。

第7页：SDS-PAGE原理

• 蛋白质与SDS按1︰1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。
• 在15~200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW＝K－bm。

第8页：

本页源文件未提取到文字内容，仅有图片（位于第7页SDS-PAGE原理与第9页不连续系统说明之间）。建议对照原课件图片补充本页要点说明。

第9页：不连续系统与连续系统

不连续系统

缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度不连续，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。

连续系统

电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，只有电荷效应与分子筛效应。

第10页：浓缩效应

三个不连续性构成浓缩效应：

1. 凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）。
2. 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl^-低、比Gly高。
3. 电位梯度不连续性：快离子（Cl^-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，两者之间形成稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。

第11页：实验结果分析与标准曲线

实验结果分析：绘制标准曲线 log MW＝K－bm。

相对迁移率

相对迁移率＝蛋白质区带中心至分离胶上沿距离／溴酚蓝至分离胶上沿距离。

作图方法

以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标、相对迁移率作横坐标作标准曲线，再计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。

第12页：低分子量标准蛋白

原文以连写方式列出各标准蛋白名称与分子量，此处已拆分为两列。

第13页：实验试剂

• 30%丙烯酰胺（Acr）。
• 10% SDS。
• 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液。
• 1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液。
• 10%过硫酸铵（AP）（现配现用）。
• TEMED（四甲基乙二胺）。
• 2×样品缓冲液。
• 10×电极缓冲液母液（pH8.3）。
• 染色液。

第14页：

本页源文件未提取到文字内容，仅有图片（位于第13页实验试剂之后、结束页之前）。建议对照原课件图片补充本页要点说明。

第15页：结束页

End