07-2 实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量.docx

第1页：SDS-PAGE原理与公式

实验七 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

一、实验原理

• 带电颗粒（蛋白质）在电场作用下的移动速度满足 v＝q/(6πrη)·(v/d) 的关系；在同一电场强度与电极缓冲液条件下，移动速度取决于带电量q与分子大小（6πr）。若使各蛋白质的带电量相近，则移动速度只取决于分子自身大小。
• 1967年Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂SDS不影响凝胶形成，而蛋白质的电泳迁移率主要取决于其分子量大小：SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键使之变性为松散线状，大多数蛋白质与SDS按1:1.4（W/W）的比例结合（溶液中SDS总量至少比蛋白质量高3倍）。
• 结果有二：①SDS解离后带很强负电荷，使SDS—蛋白质复合物带上相同密度的负电荷，大大超过蛋白质原有电荷量，基本掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差异；②SDS与蛋白质结合后改变原有构象，使其形状近似椭圆柱形，短轴直径约18nm，长轴与分子量成正比，故迁移率不再受原有电荷与形状影响，只取决于椭圆柱长度即分子大小。
• 为使SDS与蛋白质按比例充分结合，必须将二硫键完全打开，故用SDS处理样品时必须同时用巯基乙醇处理（还原剂，使二硫键还原打开并在有多余巯基乙醇时不再氧化）。
• 1969年Weber和Osborn用此法测定约40种蛋白质，发现迁移率与分子量的对数呈直线关系：Mw＝K(10^-bm)，lgMw＝lgK－bm，即 lgMw＝K₁－bm（Mw为分子量，m为迁移率，b为斜率，K、K₁为常数）。分子量在12000~200000之间的蛋白质用此法测得结果与其它方法相比误差一般在±10%以内，重复性高。

第2页：方法特点与凝胶浓度选择

• 此方法设备简单、样品用量甚微、操作方便，已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法；测定时先将几种已知分子量的标准蛋白质与被测蛋白质同时电泳，测出各成分迁移率，以标准蛋白质分子量为纵坐标、迁移率为横坐标在半对数坐标纸上绘出直线型标准曲线（用普通坐标纸时纵坐标取分子量对数值）。
• 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）与交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成；化学聚合常用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾作催化剂，并以N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）作加速剂。叔胺要处于自由碱基状态才有效，低pH会延长聚合时间；分子氧阻止链延长妨碍聚合；一些金属也能抑制聚合；冷却使聚合变慢，通常控制在1小时内完成以保证凝胶性质稳定。
• 不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶适用于不同分子量范围：15%凝胶适用于10000~50000；10%凝胶适用于10000~70000；5%凝胶适用于25000~2000000；3.33%凝胶孔径更大，适用于更高分子量。应根据待测样品的分子量范围选择合适凝胶浓度。

第3页：适用范围与标准蛋白试剂

• 标准蛋白质应选择分子量与待测样品相近、使其分子量恰好落在标准范围内的产品。
• 此法对带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）、结构蛋白（如胶原蛋白）等因不能定量与SDS结合而偏差较大；由亚基或多条肽链组成的蛋白质（如血红蛋白、α-胰凝乳蛋白酶）在SDS作用下解离，测得的是亚基或单条肽链的分子量，这些蛋白质不宜用此方法测定，必需时应作对照实验。
• 本实验选用分子量在10000~70000范围的标准蛋白质，使用10%的聚丙烯酰胺凝胶，参照U.K.Laemmli（1970）方法以板状不连续电泳系统进行电泳。

本表标准蛋白质为中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂出品，市售其他标准蛋白产品亦可使用。

（2）凝胶试剂

• 30%（W/V）丙烯酰胺：30g丙烯酰胺、0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于100mL蒸馏水中，储于4℃暗处，1个月内可使用。
• 1mol/L pH8.8 Tris—HCl缓冲液：Tris 121g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.8后定容至1000mL。
• 1mol/L pH6.8 Tris—HCl缓冲液：Tris 121g溶于蒸馏水，用HCl调至pH6.8后定容至1000mL。
• 10%（W/V）SDS。
• 10%（W/V）过硫酸铵（用前现配）。
• TEMED。

第4页：缓冲液与制板操作

• （3）10×电极缓冲液母液（pH8.3）：Tris 30.3g、甘氨酸144.2g、SDS 10g溶于蒸馏水并定容至1000mL，使用时10倍稀释。
• （4）2×加样缓冲液：SDS 400mg、巯基乙醇1mL、甘油3mL、溴酚蓝4mg、1mol/L pH6.8 Tris—HCl 2mL，用蒸馏水定容至10mL；按每份0.5~1.0mL分装，-20℃贮存。以此液制备样品时，固体样品应稀释1倍使用，液体样品则加入等体积原液混合。
• （5）染色液：考马斯亮蓝R250 1g、甲醇450mL、冰醋酸100mL、加水450mL，溶解后过滤使用。
• （6）脱色液：甲醇450mL、冰醋酸100mL、加水450mL混匀使用；使用后的脱色液用活性炭吸附过滤后可重复使用。
• （7）1.2%琼脂。（8）微量加样器（50μL）。（9）电泳仪。（10）脱色摇床。

操作方法 1．制板

1. 凝胶可注入玻璃管铸成柱状进行圆盘电泳，也可注入两块玻璃板间隙铸成板状进行垂直板状电泳，本实验选用板状电泳。
2. 根据电泳槽高矮大小选择两块大小一样的玻璃板，其中一块一端带有2~3cm高的凹槽；在无凹槽玻璃板两边放间隙条（可涂凡士林增加密封性），放上带凹槽玻璃板后用夹子固定，两板间即形成间隙。
3. 间隙下端应封闭以防胶液漏出：一般用胶纸封闭，灌胶凝固后撕去；或用1.2%~1.4%浓度的琼脂封闭，将带间隙的玻璃板装置垂直放在小槽内倒入热琼脂液，冷却后取出即封严，可灌注胶液。
4. 市售垂直板状电泳槽型式较多（如夹心式），可根据具体要求操作。

第5页：分离胶与浓缩胶配制

TEMED灌胶前现加，加后立即混匀。本实验分离胶浓度为10%，凝胶液总用量根据玻璃板间隙体积而定。将胶液充分混匀后迅速注入两块玻璃板间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3cm左右，然后在胶面上轻轻铺0.5cm高的水（顺玻璃板慢慢加入，勿扰乱胶面），垂直放置于室温约20~30min使之凝聚，此时凝胶与水之间可见清晰界面，然后倒掉胶面上的水。

浓缩胶一般用3%~5%（本实验用5%），用量根据实际情况而定。

第6页：样品制备、加样与电泳

1. 充分混合浓缩胶溶液后灌入玻璃板间隙中，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，而后插入梳子，室温放置20~30min使浓缩胶凝聚；凝聚后慢慢取出梳子，防止把胶孔弄破。
2. 取出梳子在胶孔中加入蒸馏水冲洗未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水再加入电极缓冲液。
3. 将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴形成贮液槽，加入电极缓冲液使其与胶孔中的缓冲液接触；在电泳槽下端的贮液槽中也加入电极缓冲液。

4．样品制备

标准蛋白质样品

可分别单个制备后放入不同胶孔，一般将几种标准蛋白质混合放入一个胶孔：称取各种标准蛋白质0.5mg放入试管或1.5mL塑料管中，按0.5mg/mL的比例加入1倍稀释的2×样品稀释液使之溶解，按每管20~100μL分装，-20℃冰箱备用；每次用1管，用前置沸水浴加热2min，取出冷却至室温备用。商品成套标准蛋白质样品按说明配制。

待测蛋白质样品

固体样品制备方法与标准蛋白质相同；液体样品如血清则取一定量加入等体积2×加样缓冲液，混匀后置沸水浴2min，冷却备用；样品太稀可经浓缩后再制备。制备好的样品未用完可于-20℃保存，存放时间较长再用前应在沸水浴中加热1min，但同一样品重复处理次数不宜过多。

5．加样

• 加样量不可过多或过少：样品中至少应含有0.25μg蛋白质染色后才能检测得出，1μg蛋白质则十分明显；点样体积根据样品浓度与凝胶孔大小可在10~100μL之间。
• 用微量取样器吸取已处理好的标准蛋白质样品20μL（需分别加入不同胶孔且只有1支取样器时，加完第1个样品后应洗净再吸取第2个样品，以免相互污染）；将针头穿过凝胶孔上的缓冲液使样品落在凝胶面上，推取样器要慢，用力过猛会使样品扩散到缓冲液中。以同样方法加入20μL待测蛋白质样品；为获得准确结果每个样品应做两个。

6．电泳及结果测量

• 将电泳槽与电泳仪相连结，上槽为负极、下槽为正极，打开电源开关，选择适合电压保持恒电压进行电泳，直至样品中染料迁移至离下端1cm时停止电泳（一块150mm宽、100mm长、1.5mm厚的胶，用100V、20mA电泳约3h）。
• 吸尽上下电泳槽中的电极缓冲液，取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，测量分离胶的长度（染色前胶长）及分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离（染料移动距离）并记录；或在溴酚蓝带中心插入一段细铜丝以标出染料位置。

第7页：染色脱色与迁移率计算

1. 测量完毕，除去浓缩胶层，将分离胶部分取下，在染色液中浸泡染色1小时左右。
2. 倒去染色液，用蒸馏水漂洗3~5次，然后加入脱色液，室温浸泡凝胶或37℃加热使其脱色，更换几次脱色液，直至蛋白质区带清晰为止。
3. 将胶片小心放在一块玻璃板上，测量脱色后分离胶的长度（染色后胶长）及各蛋白质条带的移动距离（分离胶上沿至各蛋白质区带中线的距离）并记录，或测量由胶上沿至铜丝的距离及各蛋白质区带的距离。

每种样品做两份（1、2）取平均值。

8．电泳迁移率的计算和标准曲线的制作：各蛋白质样品区带的迁移率按下列公式计算：

迁移率＝（蛋白质移动距离／染料移动距离）×（染色前胶长／脱色后胶长）

以各标准蛋白质样品迁移率作横坐标、蛋白质分子量作纵坐标，在半对数坐标纸上作图即可得一条标准曲线（也可取蛋白质分子量的对数值用一般坐标纸作图）。

第8页：结果判定与思考题

测得待测蛋白质的迁移率后，由曲线上即可查出其分子量。

思考题

1. 除电泳外，常用的测蛋白质分子量的方法还有哪些？
2. 什么是SDS-PAGE的浓缩效应和分子筛效应？
3. 凝胶电泳中的分子筛效应与凝胶过滤中的分子筛效应有何异同？