18 实验十 二 质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化.doc

第1页：实验十二 质粒DNA的小量制备与转化

• 实验十二质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化Ⅰ.质粒DNA的小量制备一实验目的学习并掌握质粒的小量制备技术。二实验材料和用具菌种：E.coliDH5/pUC19培养基：LB：Tryptone1%，YeastExtract0.5%，NaCl1%，pH7.2(Agar2%)；120℃灭菌20min。D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品）恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、EP管（Eppendorf管，1.5ml微量离心管）、加样器、吸头等。三原理实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。四实验内容1.细菌培养及菌体的收获。2.用试剂盒进行小量质粒制备。五实验步骤1.将E.coli菌株接种到液体LB培养基中，加入氨苄青霉素至100
• g/ml，150rpm振荡16h；2.吸取1.5ml培养菌液与1.5ml离心管中，13000rpm室温下离心2min。倒掉上清，然后倒置于吸水纸上，使液体流尽；

第2页：质粒DNA小量制备的操作步骤

• 3.加入150
• l溶液Ⅰ，vortex或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。4.加入200
• l溶液Ⅱ，颠倒离心管6~8次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡；5.加入500
• l溶液Ⅲ，颠倒6~8次，可见白色絮状物产生；6.13000rpm离心10min。离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管；7.直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000rpm离心1min，使质粒结合于纯化柱上；8.倒弃收集管内的液体，在质粒纯化柱内加入750
• l溶液Ⅳ，13000rpm离心1min，洗去杂质；9.倒弃收集管内液体，13000rpm离心1min，除去残留液体；10.将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加50ul溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min；11.13000rpm离心1min，所得液体就是质粒。质粒于-20℃冰箱保藏备用。六注意事项1.在使用前，在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇，然后在瓶盖上作好记号。2.溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再使用。溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。七思考题1.加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？附录一：pUC19图谱

第3页：质粒DNA的电泳检测

• Ⅱ.质粒DNA的电泳检测一实验目的学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。二实验材料琼脂糖，TAE缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭（EB），标准分子量Marker电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等三实验原理琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的有效方法。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA.。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。四实验内容对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测。五实验步骤1.制胶（见图3）(1)胶模两端用胶带封严，架好梳子备用；(2)称取0.2g的琼脂糖于100ml烧杯中，加入20mlTAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却到60℃左右加入EB（终浓度0.5
• g/ml），摇匀，即倒入胶模中凝固30min以上；(3)临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液TAE（淹过胶面），拔取梳子备用。2.样品准备取已提取好的质粒DNA5
• l于500
• l指管中，加入1
• l的加样缓冲液，混匀；3.电泳(1)将样品和5
• l标准分子质量分别点样到梳孔中；

第4页：电泳条件与结果观察

(2)恒压50v，电泳60分钟左右；

(3)电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。

图3灌制水平琼脂糖凝胶

第5页：质粒DNA电泳结果分析

• 六实验结果将质粒DNA条带与DNAMWMarker进行比对，对质粒提取结果进行分析。七注意事项溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。附录一溴化乙锭稀溶液的处理(适用于含有0.5
• g/ml的溴化乙锭的电泳缓冲液)方法一1.每100ml溶液中加入2.9gAmberliteXAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm& Haas公司购置；2.于室温放置12小时，不时摇动；3.用Whatman1滤纸过滤溶液，丢弃滤液；4.用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物予以丢弃。方法二5.每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；6.于室温放置1小时，不时摇动；7.用Whatman1号滤纸过滤溶液，丢弃滤液；8.用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以丢弃。附录二1.电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）：0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA。浓储藏液液（50×TAE）：每升含有242gTris碱，57.1ml冰乙酸，10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）2.0.5mol/LEDTA（pH8.0）在80ml蒸馏水中加入18.61gEDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1000ml，分装后灭菌备用。

第6页：大肠杆菌的转化实验

• Ⅲ大肠杆菌的转化实验一实验目的学习并掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术。二实验材料和用具菌种：E.coliDH5；质粒：pUC19；培养基：LB：1.LB液体试管：5ml/管；2.LB液体三角瓶：20ml/250ml三角瓶；3.LB+Amp平板：Ampicillin加量100
• g/ml；器材：恒温培养箱、恒温摇床、离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、涂布棒、EP管、可调移液器、吸头等。三实验原理转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。用于转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，以防止对外源DNA的切割。质粒能否进入受体细胞取决于该细胞是否处于容易吸收外源DNA的感受态。细胞的感受态可以通过理化因素诱导产生。大肠杆菌是常用的受体菌，其感受态一般是通过用CaCl2在0℃条件下处理细胞而形成。细胞处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，转化混合物中的质粒DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在LB培养基上培养数小时后，球形细胞复原并增殖，在选择培养基上便可获得所需的转化子。四实验内容1.制备E.coliDH5的感受态细胞；2.进行质粒pUC19的转化

第7页：转化实验的操作步骤

• 五操作步骤1.菌种在LB液体培养基中活化，37℃，150rpm振荡培养过夜；2.转接到新鲜LB液体培养基中，接种量5%；3.37℃，150rpm培养至OD600=0.2~0.25；4.将培养液放入冰浴冷却10min；5.取1.5ml培养液于6500rpm离心5min，弃上清液；6.加0.75ml冰冷CaCl2溶液（50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris，pH8.0），用混匀器混匀或用手指弹离心管混匀；7.将离心管置于冰浴45min；8.6500rpm5min离心收集细胞；9.将细胞小心悬浮于0.1ml冰冷CaCl2溶液中（用移液器小心混匀）；10.加1
• l质粒，小心混匀，置冰浴45min；11.将离心管置于42℃恒温水浴热处理2min（准确！）；12.加1mlLB液体培养基后于37℃、150rpm振荡培养1h；13.取0.1ml培养液涂布至LB+Amp平板上；14.将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。六实验结果观察转化结果，并进行分析。七思考题1.本实验成功的关键是什么？2.什么是感受态细胞，用什么方法获得感受态细胞？3.本实验中转化的原理是什么？pUC19质粒有何特点？