02 实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离DNA.ppt

第1页：质粒酶切与琼脂糖凝胶电泳

实验名称

质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离DNA

所属课程

分子生物学实验

第2页：实验二内容目录

本实验内容

• 实验目的
• 实验原理
• 实验仪器、材料与试剂
• 实验步骤
• 实验结果及讨论

第3页：实验二 实验目的

• 限制性内切酶切割出目的DNA；
• 了解琼脂糖凝胶电泳的原理；
• 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。

第4页：酶切与琼脂糖电泳原理

限制性内切酶切割

利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。

琼脂糖凝胶电泳

基因工程操作中常规的实验方法，能检测少量的DNA（肉眼观察可检测到 10 ng 的DNA），且检测范围很广。

第5页：pBC SK 质粒图谱

本页为 pBC SK 质粒图谱，用于确定限制性内切酶识别位点与酶切后片段的大小。

第6页：

第7页：溴化乙锭荧光显色原理

• 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光；
• DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动，溴化乙锭从正极向负极移动，分子嵌入DNA形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光；
• 在溴化乙锭足够的情况下，荧光强度正比于DNA的含量，可据此检测DNA浓度。

第8页：实验二 实验仪器

（一）仪器

• 水平式凝胶电泳槽
• 稳压电泳仪
• 电炉
• 紫外检测仪
• 台式离心机

第9页：

第10页：实验二 实验材料

（二）材料

• 实验一中提取的质粒DNA；
• 酶切后的质粒DNA。

第11页：实验二 试剂与缓冲液

（三）试剂

• 限制性内切酶 EcoRI；
• TAE 电泳缓冲液（50×，pH 8.0）：Tris 242 g、冰醋酸 57.1 ml、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 ml；
• 溴化乙锭溶液 10 mg/ml 水溶液，室温，棕色瓶或铝箔纸包装保存；
• 10× DNA 样品上样缓冲液；
• 琼脂糖。

第12页：EcoRI 与 BamHI 双酶切体系

实验步骤：酶切体系

37℃ 酶切 1.5 小时。

第13页：琼脂糖凝胶制备（一）

琼脂糖凝胶制备

1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干；
2. 插好挡板、梳子；
3. 根据实验所需称取 0.4 克琼脂糖，放入制胶容器（一般用三角瓶），加入 40 ml 电泳缓冲液（1×TAE）；
4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解；
5. 溶液冷至约 60℃ 时，加入溴化乙锭 4 μL（终浓度为 0.1 g/L），轻轻摇匀，倒入制胶槽，检查有无气泡。

第14页：琼脂糖凝胶制备（二）

6. 室温下约 30～45 分钟后琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中；
7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约 1 mm；
8. 在DNA样品中加入 2 μL（1/10 体积）的 10× DNA 上样缓冲液（loading buffer），混匀，稍甩一下使溶液都处于离心管底；
9. 用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。

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第16页：电泳与结果观察

10. 插上导线，打开电泳仪电源，调节电压至 120 V，电泳开始，观察电流情况或负极铂金丝是否有气泡出现；
11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳；
12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果；
13. 根据需要切下DNA条带，放入 1.5 ml Ep 管中，放于 4℃ 保存，以备后续实验用。

第17页：实验二结果及讨论

实验结果及讨论

• 质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带：最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型；
• 如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散；
• 影响限制性内切酶（RE）活性的主要因素：DNA的纯度、DNA的甲基化程度、温度、缓冲液成分（DTT、BSA）等。

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第21页：Marker DL2,000 条带大小

使用 3 mg 的 DNA Marker DL2,000（500 ng/条带）进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各条带大小如上表。

注：原文记为「3 mg」，按 500 ng/条带 × 6 条带推算应为 3 μg，此处保留原文数值供核对。