页数：12页文件大小：915.5 KB来源： 分子生物学实验ppt课件
本课件讲解向质粒载体中插入外源DNA的连接操作，先说明T4 DNA连接酶催化裂口两端形成磷酸二酯键并需ATP的原理，再给出试剂配制、10 μL 连接反应体系配比与16℃过夜反应的条件控制要点。
本实验内容
DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的 3′羟基 与 5′磷酸 之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来，反应需 ATP。
本页图示连接酶的作用：把基因连在一起，即由DNA连接酶将目的基因片段与载体分子连接为完整的重组DNA。
本页为DNA重组示意图，展示外源DNA片段与载体DNA连接、形成重组质粒的过程。
（一）仪器
（二）材料
注：原文写作「实验三回收的DNA片段」，按实验流程应为实验二（酶切电泳后切胶回收）所得的DNA片段。
（三）试剂
实验步骤
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 含有质粒载体的DNA溶液 | 2 μl |
| 插入片段DNA溶液 | 5 μl |
| 10× T4 DNA ligase buffer | 1 μl |
| T4 DNA连接酶 | 0.5 μl |
| 灭菌的双蒸水 | 1.5 μl |
Spin 后混合均匀，离心至无气泡；16℃ 反应过夜。
实验结果及讨论
下载地址：{{downurl}}
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