第1页：实验一 质粒的提取（碱法）
- 实验名称
- 质粒的提取（碱法）
- 学时安排
- 3 学时
- 所属课程
- 分子生物学实验
本实验学习碱裂解法提取质粒DNA的原理与操作方法。
第2页：实验一内容目录
本实验内容
- 实验目的
- 实验原理
- 实验仪器、材料与试剂
- 实验步骤
- 实验结果及讨论
第3页：实验一 实验目的
第4页：质粒与碱裂解法原理
- 质粒
- 细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。
- 分离依据
- 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离两者。
第5页：载体结构三要素与种类
结构的三大要素
- 多克隆位点
- 选择标记（耐药性，LacZ）
- 独立的复制单位
种类
- 质粒
- 噬菌体
- 酵母人工染色体（YAC）
- 反转录病毒载体
- 表达载体等
第6页：
第7页：pBC SK 质粒图谱
本页为 pBC SK 质粒图谱，标注载体上的多克隆位点与选择标记（耐药性、LacZ）等结构要素。
注：本课件材料中质粒编号同时出现 pBC SK 与 pBC KS 两种写法，图谱页记为 pBC SK。
第8页：T-载体
本页为 T-载体图谱。T-载体为线性化后在 3′端突出单个 T 的载体，可直接与带 A 尾的 PCR 产物连接。
第9页：碱裂解变性与复性原理
- 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽断裂，但两条互补链彼此缠绕、紧密结合在一起；
- 加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性；
- 离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，质粒DNA则留在上清液中；
- 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
第10页：实验一 实验仪器
（一）仪器
- 恒温摇床
- 超净工作台
- 高压灭菌锅
- 高速台式离心机
- 微量取液器
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第16页：实验一 实验材料
（二）材料
- 含 pBC KS 质粒的大肠杆菌 DH 5α；
- 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。
第17页：LB培养基配方
（三）试剂 1. LB培养基
LB液体培养基配方（1 L）| 组分 | 用量 | 说明 |
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| 胰蛋白胨 | 10 g | 提供氮源与氨基酸 |
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| 酵母提取物 | 5 g | 提供维生素与生长因子 |
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| NaCl | 10 g | 维持渗透压 |
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| 琼脂粉 | 15 g | 仅固体培养基添加 |
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配制要点：加去离子水至 800 ml 搅拌使溶质完全溶解，用 NaOH 调节 pH 值至 7.0，再加去离子水至总体积 1 升，高压蒸汽灭菌 20 分钟。LB 固体培养基（1 L）即在上述液体培养基中加入琼脂粉 15 g。
第18页：Solution Ⅰ/Ⅱ 配方
2. Solution Ⅰ 3. Solution Ⅱ
Solution Ⅰ 与 Solution Ⅱ 配方| 溶液 | 组分 | 浓度 | 配制与保存 |
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| Solution Ⅰ | 葡萄糖 | 50 mmol/L | 高压灭菌后 4℃ 保存备用 |
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| Solution Ⅰ | Tris·Cl（pH 8.0） | 25 mmol/L | 高压灭菌后 4℃ 保存备用 |
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| Solution Ⅰ | EDTA（pH 8.0） | 10 mmol/L | 高压灭菌后 4℃ 保存备用 |
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| Solution Ⅱ | NaOH | 0.2 mol/L | 现用现配制 |
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| Solution Ⅱ | SDS | 1% | 现用现配制 |
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第19页：Solution Ⅲ 与氨苄青霉素配制
4. Solution Ⅲ（100 ml） 5. 氨苄青霉素（Amp）
Solution Ⅲ 配方（100 ml）| 组分 | 用量 | 配成后浓度 |
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| 5 mol/L KAc | 60 ml | 3 mol/L 钾盐 |
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| 冰醋酸 | 11.5 ml | 5 mol/L 醋酸 |
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| 水 | 28.5 ml | pH 4.8 |
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氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成 100 mg/ml 溶液，置 -20℃ 冰箱保存备用。
第20页：胰RNA酶与有机试剂
6. 胰RNA酶
- 将胰RNA酶（RNA 酶A）溶于 10 mmol/L Tris·Cl（pH 7.5）、15 mmol/L NaCl 中，配成 10 mg/ml 的浓度；
- 于 100℃ 加热 15 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于 -20℃。
7. 其他试剂：氯仿、乙醇、70% 乙醇。
第21页：质粒提取步骤（一）
实验步骤：质粒的提取
- 用灭菌的牙签挑取单菌落放入 50 ml LB 液体培养基（含 Amp 0.1 mg/ml）中，37℃ 振荡培养过夜；
- 将菌液倒入 1.5 ml Eppendorf 管中，10,000 rpm 离心 1 min，去掉上清液，重复两次；沉淀悬于 200 μL Solution Ⅰ 中，涡旋使充分悬浮；
- 加入 300 μL Solution Ⅱ，混匀（注意动作轻），3℃ 放置 5 min；
- 加入 300 μL Solution Ⅲ，混匀（注意动作轻），3℃ 放置 5 min。
注：原文裂解与中和后记为「冰箱 3℃ 放置 5 min」，常规操作为冰上（0℃）放置 5 min，此处保留原文表述。
第22页：质粒提取步骤（二）
- 12,000 rpm 离心 5 min，将上清移至 1 个新 Eppendorf 管中，注意所取体积（约 600 μL）；
- 加入等体积氯仿（约 600 μL），混匀（注意动作轻）。12,000 rpm、4℃ 离心 10 min，取上清液；
- 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃ 沉淀 20～30 min；
- 12,000 rpm 离心 15 min。
第23页：质粒提取步骤（三）
- 去上清，沉淀加入 500 μL 70% 乙醇洗涤 2 次（12,000 rpm 离心 3 分钟）；
- 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀；
- 每管中加入 25 μL 无菌水与 1 μL RNase，37℃ 溶解质粒DNA。
第24页：Biospin试剂盒操作（一）
Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用）
操作过程
- 将 1～1.5 ml 过夜培养的细菌菌液加入 1.5 ml 离心管中；
- 于 10,000 rpm 离心 30 秒，并弃去上清液（可重复多次以收集更多菌体，但勿过量，以免影响提取质粒的质量）；
- 加 250 μl Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀；重悬后应该没有细菌团块。
第25页：Biospin试剂盒操作（二）
- 加 250 μl 细胞 Lysis Buffer，轻柔颠倒 4～6 次；不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切；注意反应勿持续超过 5 分钟；
- 加 350 μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管 4～6 次；溶液应出现絮状物，但不会出现局部沉淀；
- 于 13,000 rpm 离心 10 分钟（如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀）；
- 将离心后得到的上清液转移到 Spin column 内，于 6,000 rpm 离心 1 分钟，并弃去接液管内液体。
第26页：Biospin试剂盒操作（三）
- 向 Spin column 内加 650 μl Wash Buffer，于 12,000 ×g 离心 30～60 秒，并弃去接液管内液体；
- 重复第 8 步一次；
- 再次于 12,000 rpm 离心 1 分钟，然后将 Spin column 转移到无菌的 1.5 ml 离心管中（不进行该步则无法保证柱内残液被彻底清除）；
- 向 Spin column 内加 20 μl Elution Buffer、去离子水或 TE 溶液，并于室温静置 1 分钟（洗脱液用量可按实际需要决定）。
第27页：质粒洗脱与保存
- 于 12,000 rpm 离心 1 分钟，1.5 ml 离心管内溶液中含有质粒DNA；
- 提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于 -20℃。
第28页：实验一结果及讨论
实验结果及讨论
- 碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作；
- 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。
