04-1 实验四 植物DNA的提取.pptx

第1页：实验四 植物DNA的提取与鉴定

实验四 植物DNA的提取与鉴定

第2页：核蛋白与研磨释放

• 真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内。
• 在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白。

第3页：氯化钠浓度分级抽提

• 在浓氯化钠溶液（1~2mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小。
• 在稀氯化钠溶液（0.14mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
• 利用不同浓度氯化钠溶液可将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。

第4页：去除蛋白质的方法

1. 在核蛋白溶液中加入氯仿－异戊醇，振荡使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。
2. 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。
3. 用苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内。

第5页：破坏DNA完整结构的因素

化学因素

核酸在pH4.0~11.0稳定，否则就变性降解。

物理因素

DNA是长链线状分子，强机械作用会使DNA分子断裂。

酶的作用

DNA酶会降解DNA分子。

第6页：紫外吸收法鉴定纯度与浓度

• 核酸的紫外吸收峰为260nm，蛋白质为280nm。
• DNA的A₂₆₀/A₂₈₀约1.8，RNA的约2.0。
• 1μg/mL的DNA溶液吸光度A₂₆₀＝0.020；1μg/mL的RNA溶液A₂₆₀＝0.022~0.024。
• 1.0个A₂₆₀相当于50μg/mL的DNA、40μg/mL的RNA。

第7页：实验步骤

实验步骤：依次为CTAB缓冲液预热与液氮研磨、65℃保温、氯仿-异戊醇抽提离心、异丙醇沉淀与洗涤、DNA溶解与纯度鉴定。

第8页：细胞破碎与抽提

1. 10mL CTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，在65℃水浴中预热。
2. 取剪碎的植物叶片适量，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。
3. 将约1g叶片粉末加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动混匀，65℃保温30分钟。
4. 加10mL氯仿-异戊醇（24︰1），轻轻混匀。
5. 室温，4000rpm离心10分钟。

第9页：沉淀洗涤与溶解

1. 用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。
2. 用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL 70%乙醇中，浸泡洗涤10分钟。
3. 用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥。
4. 将DNA沉淀溶于0.5mL TE缓冲液中。

第10页：DNA纯度与浓度鉴定

1. 取100μL DNA溶液（剩余DNA溶液放在-20℃保存）。
2. 用TE缓冲液稀释20、50和100倍。
3. 测定A₂₆₀和A₂₈₀。
4. 根据A₂₆₀/A₂₈₀判断DNA纯度。
5. 计算提取的DNA总量。

第11页：试剂

试剂：包括CTAB分离缓冲液、异丙醇、氯仿-异戊醇、液氮、70%乙醇与TE缓冲液。

第12页：CTAB分离缓冲液配方

• 2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）。
• 1.4mol/L NaCl。
• 20mmol/L EDTA。
• 100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）。
• 0.2%巯基乙醇。

第13页：CTAB的作用特点

• CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是阳离子去污剂，不仅能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸－CTAB复合物。
• 核酸－CTAB复合物可溶于≥0.7mol/L NaCl的高盐缓冲液。

第14页：有机溶剂与洗涤液

• 异丙醇：用于沉淀核酸。
• 氯仿-异戊醇（24︰1）：用于抽提去除蛋白质。
• 液氮：用于冷冻研磨破碎植物细胞。
• 70%乙醇：用于洗涤DNA沉淀。

第15页：TE缓冲液配方

• 10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）。
• 1mmol/L EDTA。

用于溶解并保存提取得到的DNA。

第16页：思考题

1. 本实验中CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？
2. 吸取样品、抽提应注意什么？为什么？
3. 提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？