第1页：实验二试剂与原理
三、试剂和器材
- 1mg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后以蒸馏水定容至100mL。
- 3,5-二硝基水杨酸试剂：称取6.3g 3,5-二硝基水杨酸并量取262mL 2mol/L NaOH，加到酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶于500mL水中），再加5g结晶酚和5g亚硫酸氢钠，搅拌溶解，冷却后定容到1000mL，贮于棕色瓶中。
- 碘－碘化钾溶液：称取5g碘、10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。
- 6N NaOH：称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。
- 0.1%酚酞指示剂。
- 6mol/L HCl溶液。
- 材料：小麦淀粉或玉米淀粉。
- 器材：分光光度计、天平、水浴锅、电炉、试管若干等。
实验二 总糖和还原糖的测定（二）——3,5-二硝基水杨酸法
- 一、目的要求
- 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
- 二、实验原理
- 在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物；在过量NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，一定浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
第2页：标准曲线与样品测定
葡萄糖标准曲线制作| 管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---|
| 葡萄糖标准液（mL） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 |
|---|
| 蒸馏水（mL） | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.8 | 0.6 |
|---|
| 水杨酸溶液（mL） | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
|---|
| 葡萄糖含量（mg） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 |
|---|
将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5mL蒸馏水，摇匀，于λ=540nm处测定吸光度；以葡萄糖含量（mg）为横坐标、光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
- 样品中还原糖的提取：准确称取0.5g小麦（淀）粉置于100mL烧杯中，先以少量蒸馏水（约2mL）调成糊状，再加入40mL蒸馏水混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌使还原糖浸出；过滤，滤液全部收集于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
- 样品总糖的水解及提取：准确称取0.5g小麦（淀）粉置于锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10mL、蒸馏水15mL，沸水浴加热0.5h；取出1~2滴置于白瓷板上加1滴I-KI溶液检查水解是否完全，已水解完全则不呈现蓝色。冷却后加1滴酚酞指示剂，以6N NaOH中和至微红色，定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中定容至刻度，即为稀释1000倍的总糖水解液。
- 样品中含糖量的测定：取总糖、还原糖、空白三管，样品溶液分别为1.0、1.0、0mL，蒸馏水分别为0、0、1.0mL，水杨酸各1.50mL，混匀后沸水加热5min，冷水冷却至室温，各加21.5mL蒸馏水摇匀，于540nm测定吸光度。
第3页：结果处理与思考题
测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。
五、结果处理：按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
- C
- 还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL。
- V
- 还原糖或总糖提取液的总体积，mL。
- m
- 样品重量，g。
- 1000
- mg换算成g的系数。
思考题
- 比色时为什么要设计空白管？
- 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？
