03-1 实验三 蛋白质N端分析.pptx

第1页：实验三 DNS-Cl法测定胰岛素的N末端

实验三 DNS-Cl法测定胰岛素的N末端

第2页：DNS-Cl标记N末端原理

二甲氨基萘磺酰氯与氨基酸（多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白质），可在紫外光照射下发出可见的荧光，灵敏度达10^-10摩尔。

第3页：DNS化反应

DNS化反应：DNS-Cl与氨基酸或多肽N末端的α-氨基在弱碱性条件下缩合，生成带有荧光的DNS-氨基酸（或DNS-蛋白质）。

第4页：胰岛素结构

胰岛素由A链与B链两条肽链经二硫键连接而成，本实验即以其A链与B链的N末端为分析对象。

第5页：标记胰岛素N末端与水解

• 用DNS-Cl标记胰岛素两条肽链的N末端（A链N末端是Gly，B链N末端是Phe）。
• DNS-胰岛素在6.0mol/L的盐酸中水解，释放出带有DNS荧光标记的DNS-Gly和DNS-Phe，其他氨基酸残基不带DNS荧光标记。

第6页：标记氨基酸标准品

用DNS-Cl标记氨基酸标准品的N末端，本实验只标记Gly和Phe两种氨基酸标准品，作为展层时的位置对照。

第7页：聚酰胺薄膜层析原理

各种被分离化合物在展层剂中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小不同，决定它们在展层过程中迁移速度的差异，从而实现分离。

第8页：聚酰胺与聚酰胺薄膜

• 聚酰胺是己二酸和己二胺的聚合物，分子中含有大量酰胺基团：nHOOC(CH₂)₄COOH＋nH₂N(CH₂)₆NH₂→聚酰胺。
• 聚酰胺薄膜是将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上干燥后制得的薄膜，含有-CO-和-NH-基团，能与被分离化合物形成氢键。
• 可用于分离酚类、酸类、醌类、硝基及胺基等化合物。

第9页：Rf值与层析图谱

Rf值（相对迁移率）：A为样品起点，B为溶剂前沿，C为层析终止时样品的色层中心，Rf＝AC／AB。

第10页：实验操作

实验操作：依次进行氨基酸标准品DNS化、胰岛素DNS化与水解、DNS-氨基酸萃取、点样与展层观察。

第11页：DNS-Cl标记氨基酸标准品

1. 取2支小试管（试管一定要清洗干净）：Phe管加0.2mL Phe＋0.2mL DNS-Cl；Gly管加0.2mL Gly＋0.2mL DNS-Cl。
2. 薄膜封口，40℃水浴反应20min。
3. 在酒精灯上将液体蒸干。
4. 各加入0.1mL 1.0mol/L HCl。

DNS-Cl标记氨基酸标准品操作完成。

第12页：标记胰岛素与酸水解

DNS-Cl标记胰岛素（老师准备！）

1. 取1支小试管（试管一定要清洗干净）：胰岛素管加0.2mL Phe＋0.2mL DNS-Cl。
2. 薄膜封口，40℃水浴反应20min。
3. 在酒精灯上将液体蒸干。

DNS-胰岛素的水解

1. 加0.5mL 6.0mol/L HCl，封口。
2. 110℃水解12~18小时。
3. 在电炉上蒸发干液体。
4. 加入0.1mL 1.0mol/L HCl。

第13页：DNS-氨基酸的萃取

1. 取3只0.5mL小塑料离心管，做好标记（Gly、Phe、insulin）。
2. 将0.1mL DNS-Gly、0.1mL DNS-Phe和0.1mL DNS-insulin分别转入对应标记的小离心管中。
3. 各加入0.1mL乙酸乙酯，盖好盖子，振荡混合后静置萃取2分钟。

第14页：点样操作

点样注意

1. 用铅笔轻轻标记点样点。
2. 点样点距薄膜底端1.5cm。
3. 用玻璃毛细管点样。

第15页：展层与结果观察

展层剂：甲酸（88%）︰水＝1.5︰100（V/V）。

1. 展层10~15分钟，等溶剂前沿到达距薄膜顶端1.0cm时停止展层。
2. 标记溶剂前沿。
3. 干燥薄膜，在紫外线下观察结果。

第16页：预期展层结果

预期展层结果：自展层起点起，沿展层方向在距底端1.5cm的基线上排列1、2、3三个样品点，上方为溶剂前沿；DNS-Gly与DNS-Phe因迁移速度不同而分开，与胰岛素水解样品对照即可判定N末端氨基酸。

第17页：DNS-氨基酸双向展层

DNS-氨基酸双向展层：在第一向展层后将薄膜旋转90°，换用第二向展层剂再次展层，可使单向展层中重叠的斑点进一步分开，用于多种DNS-氨基酸的同时鉴定。