06-2 实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化.docx

第1页：蔗糖酶原理与提取准备

实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化

原理

• 蔗糖酶（invertase，β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶，EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性；不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖就生成2mol还原糖。
• 还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此得知蔗糖水解的速度。
• 酶的提纯常需盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等多种方法交替应用；酶蛋白易变性失活，提纯操作中应始终在低温下操作以保持酶活性。
• 啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富，本实验用新鲜啤酒酵母为原料，经破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、柱层析等步骤提取蔗糖酶并测定其性质。

一、蔗糖酶的提取与部分纯化

（一）实验目的

学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。

（三）实验仪器、材料及试剂 仪器

1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱；2.电子天平、研钵（＞200mL）、制冰机、50mL烧杯；3.离心管（2mL，10mL，30mL或50mL）、移液器（1000μL）或滴管、量筒。

材料及试剂

4.市售鲜啤酒酵母（低温保存）；5.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）；6.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）；7.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液。

（四）操作步骤 1. 提取蔗糖酶

第2页：提取、热处理与乙醇沉淀

1. 将市售鲜啤酒酵母2000rpm离心10min，除去大量水分。
2. 将研钵稳妥放入冰浴中。
3. 称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50mL预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10mL去离子水，边加边研磨使蔗糖酶充分转入水相；共加75mL去离子水，研磨约40~60分钟成糊状液体（可用显微镜检查研磨效果，至酵母细胞大部分研碎）。
4. 将混合物转入50mL（或分装入2个30mL）离心管中，平衡后用高速冷冻离心机4℃、15000rpm离心15min；若中间白色脂肪层较厚，说明研磨效果良好。
5. 吸出上层有机相（弃掉）。
6. 小心取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积并记录。
7. 取出2mL放入2mL离心管中（标记为粗级分I，－20℃保存），用于测定酶活力及蛋白含量；剩余部分转入清洁的小烧杯中。

2. 热处理

1. 将盛有粗级分I的小烧杯迅速放入50℃恒温水浴中保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。
2. 取出小烧杯迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中，4℃、15000rpm离心15min。
3. 将上清液转入量筒，量出体积并记录。
4. 取出2mL放入2mL离心管中（标记为热级分II，－20℃保存），用于测定酶活力及蛋白含量；剩余部分转入清洁的小烧杯中。

3. 乙醇沉淀

1. 将盛有热处理后上清液的小烧杯置于冰浴下，逐滴加入预冷的等体积95%乙醇，温和搅拌、放置1小时。
2. 转入清洁的离心管中，4℃、15000rpm离心15min，倾去上清并滴干。
3. 沉淀用5~8mL Tris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊则4000rpm离心除去不溶物），转入量筒量出体积并记录。
4. 取出2mL放入2mL离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃保存），用于测定酶活力及蛋白含量；剩余部分转入清洁的小烧杯中用于下一步实验。

（五）实验结果与分析：记录实验结果并加以解释，若有异常现象出现可进行分析讨论。

第3页：活力与浓度测定原理及试剂

二、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定

（一）实验目的

学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力，掌握各步骤的实验原理和方法。

（二）实验原理

Nelson法：还原糖含有的自由醛基或酮基在碱性溶液中将Cu²⁺还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而确定酶的活力，测定范围25~200μg。考马斯亮蓝法：G250能与蛋白质的疏水微区结合，其磷酸溶液呈棕红色、最大吸收峰在465nm，与蛋白质结合后呈蓝色、最大吸收峰变为595nm；一定范围内595nm吸光度与蛋白质含量呈线性关系，可用于蛋白质浓度测定。

（三）实验仪器、材料及试剂

• 仪器：722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱、量筒、容量瓶、移液器、试管。
• 考马斯亮蓝（G250）染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL浓磷酸（市售质量百分浓度为85%），加蒸馏水定容至1000mL。
• 0.9% NaCl溶液。
• 牛血清标准蛋白液（0.1mg/mL）：准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至1000mL。
• 4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。
• 0.2mol/L乙酸缓冲溶液（pH4.5）：0.2mol/L NaAC（27.616g定容至1000mL）与0.2mol/L HAC（100mL乙酸定容至500mL）分别取315mL、185mL混合，用强碱调pH到4.5。
• Nelson试剂：A试剂每100mL含Na₂CO₃ 2.5g、NaHCO₃ 2.0g、酒石酸钾钠2.5g、Na₂SO₄ 20g；B试剂每100mL含CuSO₄·5H₂O 15g、浓H₂SO₄ 2滴；以A︰B＝50︰2混合使用，使用前需在37℃以上溶解防止溶质析出。
• 砷钼酸试剂：每100mL含钼酸铵5g、浓H₂SO₄ 4.2mL、砷酸钠0.6g（砷酸钠有毒，实验中注意）。

（四）操作步骤 1．各级分蛋白质浓度测定

取7支干净试管按表编号加试剂混匀，以吸光度平均值为纵坐标、各管蛋白含量为横坐标作图得标准曲线（或代入线性回归方程求出回归式与相关系数）。

第4页：各级分蛋白与标准曲线

取9支干净试管，每级分做两管；各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值落在标准曲线内，即蛋白含量在10~80μg的稀释度为宜；以吸光度平均值查标准曲线求出蛋白质含量，再计算各级分蛋白浓度（mg/mL）。

2．各级分蔗糖酶活性的测定

取9支试管按表加样，以吸光度值（O.D.）为纵坐标、还原糖（葡萄糖含量，μmol）为横坐标作图得标准曲线；在碱性条件下糖被氧化，将Cu²⁺还原成氧化亚铜。

第5页：酶活性测定与计算

取9支干净试管分两组，每级分做两管；各级分酶液应进行一定倍数稀释，先试做，选其吸光度落在标准曲线内，即还原糖含量在0.08~1.2μmol的稀释度为宜；以吸光度平均值查标准曲线求出还原糖量。

（3）活力和比活力的计算：活力单位（U）指酶在室温、pH＝4.5条件下每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。根据测得结果计算各步数据填入下表：

（五）实验结果与分析：记录实验结果并加以解释，若有异常现象可进行分析讨论。

（六）注意事项：砷酸钠有毒，Nelson与砷钼酸试剂操作时需注意防护；各级分应低温保存并避免反复冻融。