08-2 实验八 亲和纯化GST融合蛋白.docx

第1页：单柱纯化操作流程

实验八 单柱亲和纯化GST融合蛋白（Single Column Purification of GST Fusion Proteins）

N末端或C末端GST融合蛋白纯化方法：运用谷胱甘肽琼脂糖凝胶（0.5~2mL）或谷胱甘肽树脂预装柱（0.5~1mL）进行纯化，适用于25~100mL的诱导培养菌（纯化2.5~10mg GST融合蛋白）。

1. 细菌培养：直接挑取表达质粒新转化的单菌落，加入25~100mL LB＋Amp液体培养基中（含氨苄100μg/mL），37℃振荡培养至OD_600nm达0.5。
2. 诱导蛋白表达：加入终浓度0.3mM的IPTG，30~37℃振荡培养3h，诱导蛋白表达，并设立阴性对照；取样10~20μL进行SDS-PAGE电泳，取样1~2μL进行Western blot鉴定。表达时间和温度可根据表达量、可溶性、稳定性调整：对37℃不稳定或不溶的蛋白，可用0.1mM IPTG于20~25℃诱导6~20h，或10~16℃振荡培养12~24h。
3. 细胞收集：5000×g离心10分钟（4℃），弃上清，-20／-80℃贮存；细胞冻融利于破碎。
4. 破碎细胞：用5~10mL裂解缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.0，0.1 NaCl）将菌体重悬，冰浴超声破碎使融合蛋白释放；15000~19000×g离心30分钟，上清即为可溶性蛋白的细胞粗提物。上样5μL进行SDS-PAGE电泳鉴定（Western按1∶10稀释，上样5μL）。
5. 谷胱甘肽树脂预装柱的平衡：用20mL缓冲液4℃进行柱平衡；每毫升谷胱甘肽树脂大约能够结合5~10mg GST融合蛋白。
6. 结合融合蛋白：用柱帽堵上，将澄清的细胞粗提物加入谷胱甘肽树脂预装柱（0.5mL或1mL），4℃放置15~30min；取少量流过液（上样5μL）与细胞粗提物的PAGE电泳比较，鉴定蛋白结合效率。
7. 洗柱：用10×5~8mL的缓冲液洗柱，可用2×5mL高盐缓冲液（0.5M NaCl）洗柱。
8. 融合蛋白的洗脱：用1~2mL（每管约1/2柱床体积）10mM谷胱甘肽的缓冲液将目的蛋白洗脱，收集4~6管。
9. SDS-PAGE电泳分析：上样5~15μL进行SDS-PAGE电泳鉴定；可通过280nm UV吸光值或Bradford蛋白检测法进行检测。

第2页：树脂再生

10. 树脂的再生：树脂可通过以下步骤再生，重复使用3~5次。

1. 用3倍柱床体积的0.3M NaOH（即蛋白剥脱液 Stripping Solution）漂洗。
2. 使树脂在该液中浸泡10分钟。
3. 用10倍柱床体积的水和2倍柱床体积的Column Buffer漂洗。

树脂可贮存于4℃。