第1页：实验五 土壤中微生物的分离纯化与活菌计数
实验五 土壤中微生物的分离纯化与活菌计数
第2页：分离纯化的目的要求
（一）微生物的分离纯化及观察
目的要求：
- 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
- 观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）。
第3页：分离纯化的基本原理
基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
- 简易单细胞挑取法（简易单孢子分离法）
- 平板分离法：选择适宜的培养基，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个或几个细胞繁殖而成的集合体，挑取单菌落可获得一种纯培养。方法包括稀释涂布平板法、平板划线分离法。
第4页：分离纯化实验器材
- 分离源
- 自采集土壤样品
- 培养基
- 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基
- 溶液或试剂
- 盛 4.5 mL 无菌水的试管，盛 90 mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶
- 仪器或其他用具
- 振荡器，无菌培养皿，无菌吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等
第5页：稀释涂布平板法编号与倒平板
一、稀释涂布平板法（全组完成）
- 编号：取无菌平皿 18 个，另取无菌水 4 支，依次标明 10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵。
- 倒平板：分别将三种培养基溶化后，冷却至 55～60 ℃ 时，每种培养基各倒 6 皿，标注培养基名称；其中，高氏Ⅰ号培养基在倒入前需先添加 10 滴 10% 的苯酚。
第6页：土壤稀释液的制备与涂布
- 制备土壤稀释液：各取 0.5 mL 稀释样加入盛 4.5 mL 无菌水的试管，各取稀释样 0.1 mL 涂布。
放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只接触一个稀释度。
涉及平板：牛肉膏平板、马丁氏平板、高氏Ⅰ号平板；稀释度设置 10⁻¹～10⁻⁵。
第7页：涂布培养与菌落观察
- 涂布
- 培养：将高氏Ⅰ号平板、马丁氏平板倒置于 28 ℃ 培养 3～5 d；牛肉膏蛋白胨平板倒置于 37 ℃ 培养 1～2 d。
- 菌落观察：观察并描述土壤样品中分离到的细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
第8页：挑取单菌落
7. 挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置 37 ℃ 和 28 ℃ 温室中培养，此后镜检是否为单一微生物；若有杂菌，继续分离纯化。
第9页：平板划线分离法
二、平板划线分离法（个人完成）
- 倒平板：将 3 种培养基溶化后，各倒一皿，并用记号笔标明培养基名称、样品编号、个人学号等。
- 划线：分别挑取土壤样品中 10⁻¹ 的土壤悬液一环，在三种平板上划线，以分离细菌、放线菌、霉菌；方法包括分区划线、连续划线。
第10页：分区划线与连续划线
- 分区划线
- 适用于浓度较大的样品
- 连续划线
- 适用于浓度较小的样品
第11页：划线后的培养与挑菌
- 培养：将高氏Ⅰ号平板、马丁氏平板倒置于 28 ℃ 培养 3～5 d；牛肉膏蛋白胨平板倒置于 37 ℃ 培养 1～2 d。
- 菌落观察
- 挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物；若有杂菌，继续分离纯化。
第12页：分离纯化实验结果
- 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因。
- 在不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
第13页：分离纯化思考题
- 如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
- 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。
第14页：平板菌落计数法
（二）平板菌落计数法
目的要求：学习平板菌落计数的基本原理和方法。
基本原理：通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内；统计数量时，根据稀释倍数与取样量、平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数（CFU）。
第15页：平板菌落计数器材
- 菌种
- 大肠杆菌菌悬液
- 培养基
- 牛肉膏蛋白胨培养基
- 仪器或其他用具
- 1 mL 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5 mL 无菌水的试管等
- 两种计数方法
- 倾注法（本次实验）、涂布法
第16页：平板菌落计数编号
操作步骤（全组完成）
- 编号：取无菌平皿 9 个，分别标明 10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶（稀释度）各三套；另取无菌水 6 支，依次标明 10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶；七支无菌吸管也依次编号。
第17页：梯度稀释与取样
- 稀释：原样 → 10⁻¹ → 10⁻² → 10⁻³ → 10⁻⁴ → 10⁻⁵ → 10⁻⁶，依次取 0.5 mL 加入 4.5 mL 无菌水。
- 取样：10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶ 三个稀释度各取 0.5 mL（另取 0.2 mL 备用）。
原文取样量为连排数字，0.5 mL 与 0.2 mL 的对应关系未能确定，此处按原样保留说明，建议对照原课件图片核对。
第18页：倾注法倒平板与计数
- 倒平板：倒入融化后冷却至 45 ℃ 的培养基 15～25 mL，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
- 培养：37 ℃ 倒置培养 48 h。
- 计数：选择每个平板上长有 30～300 个菌落数的稀释度计算样品含菌量。
第19页：平板菌落计数结果
- 依据实验结果，分析本次数据是否可靠。
- 计算每毫升大肠杆菌菌悬液的含菌量。
本页原文标注结果填入教材 P34 表格，原课件为空白待填表格，需按实际计数结果填写。
第20页：平板菌落计数思考题
- 为什么熔化后的培养基要冷却至 45 ℃ 左右才能倒平板？
- 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
- 当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
- 用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48 h）后观察结果？
第21页：倾注法与涂布法
两种计数方法图示：倾注法与涂布法。
第22页：倒平板的持皿手法
倒平板手法：a 皿加法；b 手持法。
第23页：
第24页：细菌放线菌霉菌菌落
菌落形态对照图：细菌、放线菌、霉菌。
