05-1 实验五(一) 培养基的制备与灭菌.pptx

第1页：实验五 培养基的制备与灭菌

实验五

（一）培养基的制备与灭菌

实验五、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数

第2页：培养基制备的目的要求

一、培养基的制备

目的要求：

• 明确培养基的配制原理
• 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤

第3页：培养基的分类

基本原理

按培养基的用途分

基础培养基、鉴别培养基、选择培养基

按培养基的物理状态分

固体培养基、半固体培养基、液体培养基

按成分不同分

天然培养基、合成培养基、半合成培养基

第4页：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配方

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）。

pH 7–7.2，121 ℃ 灭菌 20 min。

第5页：高氏Ⅰ号培养基配方

高氏Ⅰ号培养基（一种合成培养基，可用于培养放线菌）。

pH 7.2～7.4，121 ℃ 灭菌 20 min。

第6页：马丁氏培养基配方

马丁氏培养基（一种合成培养基，可用于分离培养真菌）。

pH 自然，121 ℃ 灭菌 30 min；使用前添加链霉素。

第7页：固体淀粉培养基配方

固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子物质水解的生理生化鉴定）。

灭菌条件 121 ℃、20 min。

第8页：葡萄糖蛋白胨水培养基配方

葡萄糖蛋白胨水培养基（一种鉴别培养基，用于肠道菌的生理生化鉴定）。

pH 7.0～7.2，112 ℃ 灭菌 30 min。

第9页：培养基配制器材

溶液或试剂

4 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、各类培养基的配方药品

仪器或其他用具

试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH 试纸（pH 5.5～9.0），硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等

第10页：培养基配制步骤一

操作步骤（一）

1. 计算：根据配方按照用量计算。
2. 称量
3. 溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。
4. 调节 pH：用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节，以 pH 试纸或 pH 计测定。
5. 过滤：趁热用四层纱布过滤（本次实验省略）。

第11页：培养基配制步骤二

操作步骤（二）

6. 分装

• 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的 1/4 或 1/3。
• 三角烧瓶：以总体积的一半为限。
• 管口或瓶口不得沾有培养基。

第12页：培养基分装加塞

操作步骤（三）

7. 加塞

1. 正确
2. 管内部分太短，外部太松
3. 外部过小

第13页：包扎灭菌与搁置斜面

操作步骤（三）

8. 包扎：注明培养基的名称。
9. 灭菌：按不同培养基所需的温度、时间灭菌。
10. 搁置斜面：为试管长度的 1/3～1/2，不能超过 1/2。
11. 无菌检查

第14页：无菌器皿的准备

实验无菌器皿的准备

• 无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，经 121 ℃、20 min 灭菌。
• 无菌移液吸管、培养皿：报纸包扎后，经 121 ℃、20 min 灭菌。

第15页：

第16页：消毒与灭菌的目的要求

二、消毒与灭菌

目的要求：了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

第17页：消毒与灭菌的基本原理

基本原理

灭菌

杀死一切微生物的营养体、芽孢和孢子

消毒

消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。

第18页：常用灭菌方法分类

干热灭菌

火焰灼烧法、干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）

湿热灭菌法

加压蒸汽灭菌法

其他

紫外线灭菌法、微孔滤膜过滤除菌

第19页：火焰灼烧法

火焰灼烧法：直接在火焰上灼烧灭菌，主要用于实验室接种针（环）、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。

第20页：干热灭菌法

干热灭菌法

设备

电热烘箱

适用

耐高温器皿

条件

160–170 ℃，维持 2 小时

注意事项：

1. 温度不可超过 180 ℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。
2. 灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。
3. 灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。
4. 电烘箱内温度＜70 ℃ 时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

第21页：高压蒸汽灭菌法

2. 湿热灭菌（一）

高压蒸汽灭菌法：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内 0.1 MPa、121 ℃ 保持 15～30 min 进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高、时间长？在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。

第22页：蛋白质含水量与凝固温度关系

原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。

蛋白质含水量越高，凝固所需温度越低。

蛋白质含水量与凝固所需温度的关系：含水量越高，30 分钟内凝固所需温度越低。

第23页：湿热穿透力与潜热

原因二：湿热的穿透力比干热大。

原因三：湿热的蒸气有潜热存在。

本页原文含一组「灭菌透过布层的温度」对照数字，因提取时数字连排、无法安全还原为表格，此处按要点文字呈现，建议对照原课件图片核对具体数值。

第24页：饱和蒸汽与冷空气排尽

在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以排气是否完全很重要。

第25页：间歇灭菌煮沸消毒与超高温杀菌

2. 湿热灭菌（二）

间歇灭菌法

应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基，如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等；用阿诺氏流动蒸汽灭菌器，每天加热 100 ℃、30 min，连续三天，可彻底灭菌。

煮沸消毒法

注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法，一般煮沸消毒时间为 10～15 min。

超高温杀菌

在温度 135～150 ℃、时间 2～8 s 的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。

第26页：高压蒸汽灭菌操作步骤

高压蒸汽灭菌法操作步骤（三）

本页源文件仅提取到「操作步骤」标题，具体流程见后续页面，建议对照原课件图片核对。

第27页：手提式高压蒸汽灭菌锅

手提式高压蒸汽灭菌锅（图示）：主要由锅体、压力表、排气阀与安全阀等构成。

第28页：全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅

全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅（图示）：配备数显控制面板，可设定灭菌温度与时间。

第29页：灭菌锅操作步骤

操作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）

1. 装锅：先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。
2. 加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。
3. 灭菌：加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至 121 ℃ 时维持 15～20 min。
4. 降温取物：灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至 0 时，打开排气阀，开盖取物。

第30页：加压蒸汽灭菌注意事项

加压蒸汽灭菌法：0.1 MPa、121 ℃、20 min。

注意事项：

1. 切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
2. 锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
3. 压力一定要降到「0」时，才能打开排气阀，开盖取物。
4. 灭菌全程必须有人看守。

第31页：紫外线灭菌法

紫外线灭菌法：适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过 1.2 m 为宜。若紫外线照射与 3%～5% 的石炭酸溶液或 2%～3% 的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。

注意事项：

• 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。

第32页：过滤除菌法

过滤除菌法：适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。

滤膜孔径

≤ 0.22 μm

缺点

无法去除培养液中的病毒和噬菌体

第33页：消毒灭菌与培养基思考题

1. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
2. 在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？
3. 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
4. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高、时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。
5. 在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降到「0」时才能打开排气阀、开盖取物？

第34页：