第1页：实验八多聚酶链式反应
实验八 多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术
第2页：一、实验目的
- 一．实验目的及背景
- 多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
- ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。
第3页：模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：
第4页：１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng
- １．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。
- ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
- ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。
- ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。
- ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
第5页：６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性
- ６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
- ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。
- ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。
第6页：二．实验试剂及仪器
- 二．实验试剂及仪器
- １０×buffer:500mMKCl
- 100mMTris-HCl(pH9.0)
- 0.1%明胶
- 1%TritonX-100
- MgCl22.5mM
- ４×dNTP:1mM
- 引物：TGGCCGAGCTG5.0uM
- 模板：20ng/μl
- Taq酶：5u/μl
- PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
第7页：三.实验方法
- 三.实验方法
- １．向无菌的500μlEppendorf管中依次加入以下溶液。
- 反应物体积
- 10×buffer2.5μl
- 4×dNTP(1mM)2.5μl
- MgCl2(25mM)2.5μl
- 无菌水10.5μl
- Taq酶(1U/ul)1μl
- 引物2μl
- 模板ＤＮＡ(20ng)4μl
- 总体积25μl
第8页：2．反应体系混匀，离心
- 2．反应体系混匀，离心
- 3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环
- ９4℃变性１分钟
- 36℃退火１分钟
- 72℃延伸２分钟
- 经过40个循环
- 4．７２℃延伸反应7分钟。
- 5．取20μl反应液加4μlLoadingbuffer在
- 6.１．５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。
- 7.在凝胶成像系统上观察记录实验结
第9页：四、实验结果
- 四.结果分析
- １．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增产物分子量。
- 问题与讨论：
- １．简述ＰＣＲ基本原理
- ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意哪些问题。
