页数：11页文件大小：167.0 KB来源： 现代生物学实验ppt课件
本课件为《现代生物学实验》的实验六血清抗体的分离与纯化部分，依次展开一教学要求、三材料与器材（略）等内容，并说明目的要求、原理、试剂器材、操作步骤与注意事项，便于课前预习和实验现场对照操作。
二实验原理常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。
盐析法原理水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33%（NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。
离子交换层析原理利用蛋白质的酸碱性质，使蛋白质混合物与离子交换纤维素的酸性基或碱性基相结合。由于盐类的存在可以降低离子交换剂的离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静电相互吸引，通过改变溶液中盐类离子强度和PH可以将蛋白质分离。层析血清IgG的常用纤维素为DEAE-32
目前，普遍采用的方法是将硫酸铵盐析与DEAE-32离子交换柱层析法结合起来，即先采用2步硫酸铵盐析法粗提，再经离子交换柱层析得到较纯的IgG
三材料与器材（略）
四操作步骤 免疫血清1mL ↓加1mL生理盐水 逐滴加入饱和（NH4）2SO42mL（此时为50%饱和度） 4℃，静置20min↓3000r/min离心20min 取沉淀溶于2mL生理盐水中 ↓ 逐滴加入饱和（NH4）2SO41mL（此时为33%饱和度） 4℃，静置20min↓3000r/min离心20min 取沉淀溶于0.5mL生理盐水中 ↓ 装入透析袋
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↓对0.0175mol/L pH 6.3 PB透析1d，其间换液6次↓DEAE纤维素层析↓将蛋白含量高的收集管内液合并，测蛋白含量（mg/mL)并进行纯度鉴定
五注意事项（1）.盐析时注意饱和硫酸铵加入血清中的速度和方式，边加边缓慢摇动，并避免产生气泡。（2）.注意区别前后2次盐析所采用的饱和硫酸铵的终浓度。（3）.注意检查层析住的情况，主要明确层析住是否均匀，表面是否平整，有无气泡、裂隙。
六思考题（1）记录个管收集样品的OD值，并绘制洗脱曲线（2）对IgG的含量和纯度结果进行分析。（3）探讨影响IgG纯度的因素
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