114 二、生物化学实验教案.doc

第1页：糖实验技术模块教案1.教学目的要求

糖实验技术模块教案1.教学目的要求：1掌握淀粉制备的方法，了解生物大分子制备方法。2掌握糖的滴定分析方法，了解糖的其他分析方法。3了解糖链的生物学意义和糖链制备方法。2.教学时间：12课时、3.教学方式：讲授、实验4.讲稿实验一淀粉的提取、水解和测定利用直链淀粉和支链淀粉不溶于温水的原理，将地瓜捣碎后，静置于温水中，淀粉沉积在烧杯的底部而与组织部分分离。淀粉的水解有酸法水解和酶法水解，工业上的酸法水解是在100℃以上的高温条件下进行的，这样产生的葡萄糖会发生聚合反应，形成龙胆二糖、麦芽糖等低聚糖，还会进一步分解形成羟甲基糠醛、乙酰丙酸等化合物，这样得到的糖液色泽较深，味道变差。糖的定量测定可以根据其物理性质或化学性质，通过测定糖液的折射率、比重和旋光，可以测定出糖液中固形物的含量，工业上通常采用这类方法。通过化学反应定量的方法有滴定法和比色法，Folin-酚试剂法和碱性铜试剂法属于滴定法；3，5-二硝基水杨酸法和蒽酮反应法属于比色法。Folin-酚试剂法和碱性铜试剂法的原理相同，都是利用二价铜被还原糖还原成一价铜，再测定一价铜的含量而对还原糖的含量进行间接测定，但后者对前者作了改进，在滴定过程中，反应液无须处于微沸状态。各种比色法是利用还原糖与试剂生成特殊的有色物质，且还原糖的含量与有色物质的生成量有正比关系，先做出[S]∝A的标准曲线,测出待测还原糖的A后,从标准曲线上求出还原糖的含量.实验二酶的激活剂和抑制剂酶的激活剂大部分是无机离子,包括钠离子、钾离子、钙离子等阳离子和氯离子、溴离子、碘离子等阴离子;此外,小分子有机物,如抗坏血酸、谷胱甘肽等,对含-SH的酶有激活作用,EDTA、柠檬酸等能去除酶的抑制剂,也属于激活剂.

第2页：《生化样品制备与分析》第一阶段总结一

《生化样品制备与分析》第一阶段总结一、成绩与问题:我们利用四周的时间完成了8个实验,已完成了第一阶段的教学任务.总体感觉不错,表现在:Δ、同学的学习态度认真,有相当部分同学预习较深,实验原则掌握透彻,试验进展顺利,结果较好;部分同学试验出现失误,但能多次重做到获的良好结果为止.Δ、同学们准时到课室,没有出现缺课,逃学现象.Δ、其他实验室规章制度遵守好,如损坏东西登记,卫生做得特别好.Δ、教师上课认真负责,各方法原理交代清楚,讲课有宽度、深度,便于学生综合思维,示范指导认真.Δ、良好地完成从淀粉提取→酸解→总糖定量测顶的系统和以抽取的淀粉为底物的淀粉酶专一性→抑制与激活剂→最佳PH→最佳酶促反应温度→酶反应动力学系统的学习.表现还欠缺的问题：Δ、部分同学预习不够深入，对方法原理体会不深，对操作步骤中为什么要这样做而不能那样做的问题理解不够，出现操作上的失误。如温度对酶活性影响中，为什么要设计置冰箱理解不好。Δ、操作上的失误还表现在一些常规的操作方法掌握不牢。如移液管的使用、分光光度计使用上的不规范等；如同组的重复样品，OD值有0。287、0。183这样大的误差等。Δ、实验报告中所反映出的实验数据理想化（被修改过），写作也不规范。Δ、仪器数量少，试剂浪费严重等。二、与糖有关的实验的拓展糖生物学被称为继核酸蛋白质之后的第二里程碑，其反馈的生物信息却远远大于核酸和蛋白质，其重要性涉及到受体、供体、信号传导、免疫、生物合成代谢等生物学重要问题，所以我们虽然学习了糖的一个系统性实验，这个系统的取材是淀粉丰富的材料甘薯，是多糖，含葡萄糖，而生物学中的许多内容与生物研究有关热点是糖蛋白，其种类繁多，组成复杂，所以所学习的系统表现出简单化的局限性。因此同学们会问：糖蛋白中的寡糖和糖链是怎样分离纯化的？其设计原理是什么？请看这张

第3页：分离纯化程序图：（一）糖蛋白中寡糖和糖链

分离纯化程序图：（一）糖蛋白中寡糖和糖链的分离纯化高等动、植物，微生物，地衣海藻等材料——醇、醚回流脱脂（冷水，热水，碱性水，酸性水）水抽提（含有许多杂物质，如无机盐，低分子和大分子有机物）分离离子交换、凝胶过滤、透析（去掉小分子）蛋白酶，木质素酶等酶解（去掉原有大分子蛋白）——氯仿或三氟三氯乙酸振荡（得水相，去蛋白）分部沉淀法盐析金属络合法纤维素柱层析凝胶层析离子交换层析加30%醇或酮得沉淀物（大分子糖组分）溶液相纯化加50%醇或酮得沉淀物（中等分子组分糖）溶液相加更高浓度的醇或酮得沉淀物（小分子组分糖）废液——

第4页：其中部分介绍如下

• 其中部分介绍如下：
• 盐析：不同糖在不同盐浓度中具有不同溶解度而逐步析出，如NaCl，KCl，（NH4）2SO4等，后者最佳。
• 金属络合法：有些多糖能与铜、钙、钡等络合而沉淀，得到纯化物应该是盐类。
• 纤维素柱层析：多糖混合物用4倍体积乙醇全部沉淀于惰性多孔的纤维素柱上面，然后用由高到低的不同浓度的乙醇洗脱，则不同多糖按小分子组分到大分子组分的顺序被洗脱出来。上述各种纯化方法可以灵活、交替使用，以求获得单组分的样品。（二）有了纯化的单组分的糖，我们可以研究组分中单糖的组成，常用的方法有：Δ、纸层析展层剂常用的是：正丁醇：乙酸：水为4：1：5，用上层。该展层剂可把葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，L-岩藻糖，葡萄糖醛酸，氨基葡萄糖及氨基半乳糖依迁移率的不同而分布在滤纸的不同的位置，而同时用已知单糖点样，层析为参比，即可分析出某组分的糖组成。（示范操作过程及结果分析，今后我们会做这方面实验。）Δ、薄层层析法（thinlayerchromatography，TLC）。常用的为硅胶G（相当于滤纸）；展层剂可采用上。Δ、气相层析（气相色谱）流动相——惰性气体，如CO2，N2等。固定相——担体颗粒表面所包裹的一种高沸点有机化合物。塔板理论。Δ、HPLC在液、固相中分配时，与固定相亲和较弱的组分就快速通过层析柱而被记录或收集，反之较后被记录。前两法可用显色法检测。Δ、苯胺-二苯胺显色剂：80℃、10min,醛糖显蓝、蓝紫色或蓝绿色，酮糖呈棕色，检出限量为10ug.Δ、苯胺-邻苯二甲酸显色剂：105℃、5-10min,戊糖显鲜红色,巳醛糖及糖醛酸为棕色,在紫外光下有荧光,而一般戊糖则无荧光,可用来区别戊糖及巳糖,灵敏度为1ug.氨基葡萄糖呈浅棕斑点,紫外下呈黄绿色荧光。

第5页：实验加样表

后两法可用内标法定性(解释内标法)。Δ、非还原糖可采用苯酚-硫酸法。（三）、粗纤维的测定在自然界中，还存在一类水不解，人畜无法消化、利用，稀酸、稀碱不溶的天然有机物，无法按上述程序所纯化，也无法按已做的实验方法所提纯，它们在食品、饲料工业中被作为一种常规的组分进行分析，它们被称为粗纤维。由于它们在工业上占有重要位置，所以在这里介绍粗纤维的提取与测定。Δ、原理：*、稀酸水解——去除样品中的淀粉，果胶质和部分纤维素。*、氢氧化钠水解——去除蛋白质、部分半纤维素和部分木质素，并使脂肪皂化而去除。*、乙醇或乙醚洗涤——去除单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖。*、灰化——去除灰分（金属氧化物）。Δ、课前准备（实验前准备）：*、清洗器皿。*、取样，干燥。*、H2SO4和NaOH的标定：先用基准溶液邻苯二甲酸氢钾标定NaOH，配成0。313mol/l，再用标准NaOH溶液标定H2SO4，配成0。1275mol/l溶液（见P123）。*、酸，碱洗涤石棉（P15）。*、石棉的铺层和坩埚的灼烧（见P15），（600℃±15℃，2h，干燥，冷却，重称P0）。Δ、粗纤维的提取与含量分析程序（见P16）：取材研磨烘干（105℃，4h，干燥器冷却）称重（2。000g，m）乙醇、乙醚脱脂200ml，H2SO4，100℃水解半小时（冷凝管消泡）布氏漏斗过滤（尼龙布抽滤）移入三角瓶（补NaOH至200ml）沸水洗涤100℃，呈中性（蒸馏水，下同）移入烧杯（NaOH洗净尼龙布）30min，水解（冷凝管）坩埚（抽滤）沸水洗（每次50ml）10%HCl洗涤（去除酸可溶物质）95%乙醇洗涤（10ml/次，2-3次）乙醚洗涤（5-10ml/次，数次）烘干（105℃，4h）干干燥器冷却称重（坩埚+灰燥器冷却称重（坩埚+纤维素+灰分，P1）分，P2）。灼烧灰化（600℃，2h）Δ、计算：P1-P2烘干样品中粗纤维（%）=P2-P0×100，烘干样品中灰分（%）=×100，mm

本页含表格，源文件仅提取到压平文本（无分隔符），行列结构已破坏，暂无法安全还原，建议对照原课件图片补录表格。

第6页：Δ、组分分析：高温浓酸水解

Δ、组分分析：高温浓酸水解，分析。三、有关酶学实验的拓展我们完成了酶的特异性（专一性），激活与抑制，温度和PH对酶活性的影响和酶反应动力学测定5个实验。这五个实验前四个是定性的，后一个是定量的。这部分与前一部分实验的交叉点是以淀粉为底物构成的一系统。Δ、定性与定量之间的异同：*、定性是研究的前期工作，是研究必不可少的环节。*、定性分析的比较也是以定量的可比性来完成的。*、定性实验有时会设计出极端的条件，如0℃或4℃了解温度对酶活力的影响。*、实验设计的组数比较少。*、结果比较直观可见。Δ、定量分析的要求：*、应先完成定性分析，以助设计。*、可通过文献资料掌握有关信息，以助设计。*、设计组数至少5组以上。*、操作要求更为严格。*、以酶促反应速度，通过适宜的方法，比较单位时间，单位海量催化底物产生产物的增加（量）或底物的减少量来表示。Δ、淀粉水解中颜色反应由蓝变蓝紫、变紫、变紫红、变红、最后变黄的过程，表示淀粉被水解的程度，由于各种颜色的溶液的最大吸光度波长不一样，可用分光光度计分析底物的减少，也可用已学的还原糖定量分析法分析葡萄糖的增加量。Δ、拓展：＊、可通过以后要学习的实验，开展酶的分离，纯化，理化特性分析研究。＊、纯化酶可进行结构、序列分析。＊、可通过修饰等方法掌握酶的活性中心。＊、可进行酶的细胞化学定位。＊、可进行同功酶分析，了解不同物种、品种、品系的遗传性差异。