115 糖实验技术模块教案.doc

第1页：蛋白质实验技术模块教案一

蛋白质实验技术模块教案

一、教学内容：1、蛋白质分离纯化与分析：每2人一组，共18—19组×2,每组5d,5×9=45学时×2。2、DNA的制备与分析：每2人一组,共18~19组×2班,每组2d,2×9×2=36学时。

二、具体内容：cytc分离一天。生物大分子制备的原理2学时。PAGE,PI—PAGE,SDS—PAGE原理2学时。SephadexG100等层析原理2学时。分离物的SephadexG100纯化,1.5d。分离,纯化过程中所获阶段样品的SDS—PAGE跟踪及分度分析,1.5d。纯化物的进一步分析的设想,2学时。DNA分离纯化原理及注意事项,2学时。兔肝DNA的分离纯化,1d。DNA的理化性质分析，7学时。

三、教学目的:1、模拟生化大分子制备的全过程开展较为系统性的训练。2、掌握现代仪器在生化样品制备与分析中的应用及其原理。3、掌握两类生物大分子分离纯化,理化性质分析的基本原理及注意事项。四、cytc的分离：（一）实验方法步骤见教学讲义P21。（二）各步骤的基本目的与要求：取材——猪心，要求新鲜，cytc未被破坏，含cytc高，材料易得。加等量0.145mol/lTCA，使cytc从线粒体膜上解聚下来，使呈酸性可溶状态。过滤——去杂质。调PH至7.3——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白，缓慢添加。第二次加（NH4）2SO4的作用是进一步去除杂蛋白，缓慢添加。两次添加（NH4）2SO4后，cytc仍呈可溶性。静置过中午或至少2h，目的是解水合，使蛋白质凝聚成絮状，以利于通过离心方法去沉淀。加入20%TCA（25mol/l上清）——沉淀cytc。透析——去掉酸，去小分子，为上SephadexG100作准备。透析要求：低温，不漏，换透析液，用Ba+方法检查透析的效果。五、离心机：1.类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析式。2.实验室常用离心机：普通离心机——台式（3000-16000rpm）和地面式（3000-6000rpm），

第2页：一般不带冷冻设备

一般不带冷冻设备，由电机和转子所组成，转速由电压调节器调节。高速冷冻离心机——台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。上述+制冷设备及温度检测器。超速离心机——地面式，达30000rpm，0-4℃。上述+真空设备及真空检测器。3.转子：角式与水平式转子，角式常用于沉降离心，水平式还常用于梯度离心。4.离心原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加速颗粒的沉淀速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度的物质分离开。F=ω2ω2r。ω是角速度（弧度/秒）。r是颗粒的旋转半径（厘米）F是任何颗粒所经受的向外离心力。RCF=ω2r/980,RCF是相对离心力，单位为G；980是地心引力，单位为厘米/秒²。RCF=⒈119×10－5n2r,n为每分钟的转数。处于离心管内不同位置的颗粒所受的离心力不同，常以离心管中点至旋转中心距离为r时所得到相对离心图表示为平均离心力。离心力的计算使不同转速和不同离心半径的离心，统一到相同的离心中去衡量颗粒在离心中所受外加作用力的大小，以利用因不同离心机，不同转子在使用中所选择的离心时间和转速。离心时间：t= [(㏑r2-㏑r1)/ω2]/st为样品颗粒完全沉降到离心管底的时间(秒).S为沉降系数.r2为旋转轴中心到离心管底部的距离(厘米).r1为旋转轴中心到样品液液面的距离(厘米).5.离心方法:(1)差速离心法:定义，应用于沉降系数相差一~几个数量级颗粒的分离。缺点：a.分离效果差,不能一次得到纯颗粒,经再悬浮和再离心(2~3次),才能得到较纯的颗粒。b.壁效应严重,在离心管一侧会出现沉淀。c.颗粒被挤压,可能变形,聚集而失活。（2）梯度离心：定义,应用于相差较少(20%或更少)或分子量相差三倍的蛋白质。优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。c.颗粒不会挤压变形。缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不易掌握。常用的密度梯度离心方法有：蔗糖密度梯度离心；氯化铯等密度梯度离心。6.普通离心机使用注意事项:

第3页：(1).离心机要置水平位置

(1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。(2).使用前应检查套环是否平衡(台称)。(3)离心杯及其外套(离心管套)是否平衡(台称)。(4)样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子的对称位置。(5)盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。(6)启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要2~3min)。(7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间(10min)。(8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。(9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。六、生物大分子制备的实验设计（一）生物大分子制备的意义。随着分子生物学研究的进展，人们不但要研究生物体内一种物质的结构与功能，而且要研究所有物质的结构与功能。只有掌握所有物质的结构与功能，才能阐明它们是如何生物合成又是如何加工的，以最终阐明这些物质在什么阶段合成，它们的结构如何，它们在生命的生长发育和衰老中的作用。人类基因组计划的顺利完成以及后基因组计划的实施就是按照这样的思路而进行的。人类基因组计划——植物——水稻基因组计划——酵母细菌病毒的基因计划——蛋白质组学——目的是揭示生命活动的规律。可见，阐明生命不同物质结构与功能的研究已成为可能。人类遗传性，非遗传性疾病的防治，肿瘤的成因及其防治已不是理想，而将变为现实。在人们的科学研究，生产活动中，往往会遇到一些现象，如比较同种物种的不同个体，发现有一差异的mRNA，差异的蛋白质等，环境因素影响也会出现这种现象，那么人们对于掌握这一差异物质的功能就显得尤其迫切。所以生物大分子研究也成为势在必行的重要内容。而这些研究，总是以纯化这些大分子物质为前提的，所以同学们必须学习这部分内容。（二）生物大分子制备方法的特点1.生物材料组成非常复杂，常包括数百种甚至数千种化合物，各种化合物的形状，大小，分子量和理化性质各不同，其中有不少化合物迄今还是未知物质，而且这些化合物在分离时仍不断在新陈代谢中。2.有些化合物在材料中含量极微，只有万分之一，或是几十万分之一，甚至几百万分之一。如脑垂体组织提取某些激素的释放因子，蚕的信息素，竹笋的竹笋素等都是从几吨到十几吨才能得到几毫克的目的物。3.许多生物大分一旦离开生物体内环境，很快变性，破坏。因此在分离过程中必须保护这些化合物的生理活性，这也是最难做到的一点。在分离中，过酸，过碱，重金属离子，高温，剧烈的机械作用，强烈的辐射和体内自身酶的作用，均可破坏这些分子的生理活性。故分离具生物活性物质，常用十分温和的条件，并尽可能在较低温度和洁净环境下进行。4.生化分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH值，离子强度等）对溶液中各种组成综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强，实验结果往往有很大的经验成分。因此一个实验的重复性的建立，从材料至方法直至各种

第4页：环境条件

环境条件，使用的试剂药品等都必须严格的加以规定。5.为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的。（钓鱼法——亲和层析法）6.生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一性”结论。（三）生化分离制备的基本原理与一般化学分离方法原理有许多相同，相通之处。用于生物化学分离制备的技术，大都根据混合物中的不同组分分配率的差异把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（有机溶剂抽提，盐析，结晶等）。或者将混合物置于某一物相（大多数为液相）中，外加一定作用力，使各组分分配于不同区域，从而达到分离目的（如电泳，超离心，超过滤）。几乎所有有机大分子物质都不能融化和蒸发（除氨基酸脂肪酸，某些维生素外）。只限于分配在固相和液相中，并在这两相之间相互交替进行分离纯化。————————————————F1A<——————A——————F2AF1B<——————B——————F2B运动方向a色谱：吸附色谱，离子交换，分配，分子筛等。F1为流体动力；F2为表面能，范德瓦尔斯力位阻效应，静电引力，极化度分子筛效应，渗透（扩散），偶极作用，缔合和解离效应等。b电场力：F1为静电引力；F2为分子摩擦力，极化度动电作用c.扩散方法：F1为电动力，渗透力，流体动力；F2为分子筛效应电动力。d.结晶：e.沉降：F1为结晶格子能；F2扩散。F1为重力，离心力；F2为分子摩擦效应。上述分离依据：极性，离子性质及分子大小，分子大小及形状，介质密度。两物质彼此分开：F1A﹣F2A=ΔFAF1B﹣F2B=ΔFBΔFA/ΔFB=ΔF∴在分离混合物的各组分中，必须尽量设法扩大各组分之间的ΔF的差别。（四）生化分离制备实验的设计，大致可分为五个阶段：1.确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法目的：a.在原有实验方法的基础上加以改进，求更多更纯产品。b.为了获得新物质：无意识的：实验中发现异常情况的追究。有目的的：去追踪引起某现象发生的物质基础。鉴定方法：a.生物测定方法。b.理化测定方法，如呈色法，色谱法，光谱法，电泳法，核磁共振法等。

第5页：c.理化+生物测定法

c.理化+生物测定法：如虾的蜕皮激素的分离，用理化法不能用（含量极低），用丽蝇的生物测定法结合理化法，从1000Kg得2mg蜕皮激素。又如，蚕的蚕醇用气相色谱法+蚕蛾兴奋反应法。2.制备物物理化学性质稳定性预备试验A.溶解性在水或各种稀酸的溶解性。弱酸性溶剂（乙醇，甲醇，丙酮）的溶解性。各种非极性溶剂中（氯仿及各种烃类）的溶解性。B.溶液的稳定性pH稳定范围，温度效应，各种缓冲液的影响，有机溶剂的影响。C.固态时稳定性温度，水分的影响，低压冻干效应D.物理性质通过不同大小孔径膜的能力，在固体上的吸附作用，在电场中每一pH的迁移率，在超离心力场中的沉降行为。E.化学性质膜蛋白酶及其他蛋白酶，DNase，Rnase，糖类的稳定性，在温和条件下乙酰化作用的稳定性，对亚硝酸作用的稳定性，酯化作用的稳定性。3.材料处理及抽提方法的选择.处理：机械法，物理化学（反复冻融发，骤热骤冷法，超声波处理法等）及生物处理法（自溶法，酶解法，表面活性处理法）抽提：水，酸碱盐，表面活性剂，有机溶剂。4.分离纯化方法的摸索。水解酶等作用分离方法：色谱法逆流分配电泳法沉降法透析溶解度（盐析，有机溶剂抽提）5．获取制备物以后，均一性的测定。溶解度法电泳均一性测定法高速离心沉降法

第6页：实验加样表

七、PAGE原理：2、PAGE电泳的试剂，溶液的功能。CH2=CH︳—CH2—CH—[CH2—CH]x—︳C=O︳NH2︳CO︳NH︳CH2︳NH︳CO︳CH2∣CH︱C=O︳NH2C=O︳NH︳CH2︳NH︳C=O︳CH2=CH＋—CH2—CH—[CH2—CH]x—︳C=O︳NH2网状聚合物甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺催化剂：过硫酸铵，AP，在隔氧的状态下。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。PH8.3的电泳缓冲液：6g的Tris+28.8g甘氨酸→10000ml水中。电泳时使Cl¯，—Coo¯离子带动蛋白质在网状聚合物中移动。PH6.7的Tris–HClbuffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。PH8.9的Tris–HClbuffer，电泳时使蛋白质解离带电荷。溴酚兰电泳指示剂，一般迁移在蛋白质之前。R–250考马斯亮兰，蛋白质染色剂，在一个组分中含量达1ug时呈可见带。2.电泳管、板的制作：a.管垂直插入橡胶头内，距上端1cm，2cm处用蜡笔标记出。b.板用凡士林或硅胶橡胶套密封并夹入电泳槽中，直立，同上标出记号。（橡胶套密封后要用琼脂糖或琼脂密封，使成为一个长方形小室，不漏）3.灌胶：先灌分离胶：20ml，7.5%分离胶，需分离胶buff2.5ml，胶贮液5ml，10%TEMED0.1ml，混匀，用长头滴管加至第一个标记处，用蒸馏水复盖。可见一条明显折射线，以后模糊，再清晰，表明聚合完全。去水（用长条滤纸）。后灌浓缩胶：10ml，30%胶浓度，需浓缩胶buff1.25ml，胶贮液1.0ml，10%TEMED0.05ml，H2O7.65ml，10%AP 0.05ml，用长头滴管加至管的第二记号处或平板的满槽，平板加满后马上插入梳子令其聚合（约30min）。管状的加入水令其凝固。4.上样，见讲义。5.上样，见讲义。

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第7页：蛋白质在电泳中的泳动行为

6.蛋白质在电泳中的泳动行为：电泳启动时，蛋白样品处于PH6.7的上层，蛋白之上PH8.3，PH6.7层之下为PH8.9的分离胶层，上槽为负极，下槽为正极。出现了PH不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（PH6.7）Cl¯>Pro¯>—COO¯。在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯向Cl¯迁移，—COO¯向Pro¯迁移。如：一个Cl¯领路，—COO¯推动。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘aa离子在PH8.9的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而PH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就出现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开，并用R250染色而加以显示出来。八、透析：是一种把样品置于一个具有一定大小孔径的袋中，并且于水或缓冲液放置，让小分子物质与目的大分子彼此分开的过程。透析袋有现成的商品，可从公司购买。一般可去样3000dl以下的分子，可以用于脱盐而改变目的物的状态。如：（NH4）2SO4盐析所得的沉淀物，变成可溶性目的物，排除离子的干扰，保持目的物的生理活性。注意事项：1.装袋前要对袋（管）查漏，以防样品流失。2.透析管两部或袋上端要留下一定的空间，以防止水进入袋后涨破。3.袋要扎紧以防流失。4.置水或缓冲液时，包扎处最好要高离液面。5.置4℃冰箱透析以防变性。6.最好是多换透析液（4h，24h）。2-7．要用相应的方法检查透析是否完全，如奈氏试剂查NH4，BaCl2查SO4等。8．要出后把袋外水液用滤纸吸干。九、SephadexG100的工作原理：（一）、SephadexG100的结构示意图，主要参数：成为颗粒状，装于玻璃柱内，颗粒内及之间为缓冲液所占据。从柱管底部与胶颗粒交界面至柱上端胶面，所范围的体积称为柱床体积V0。胶颗粒与颗粒之间的缓冲液体积称为外水体积V外。颗粒内的缓冲液所占据的体积称为内水体积V内。胶面以下的部分空间（包括承接管）称为死空间——越小越好。V0=V外+V内+胶体积。蛋白质样品小心地铺展于胶面，待样品进胶后用洗脱缓冲液洗涤柱内壁，待洗涤液进胶后，再补加洗涤液至柱满为止，打开止水夹，开始洗脱。此时，一个混合蛋白质样

第8页：品中的大分子不能进入凝胶颗粒内

品中的大分子不能进入凝胶颗粒内，而在洗脱中随着外水体积下行，最早过柱，其洗脱体积=V外。可以进胶的颗粒（分子）中，大的在胶颗粒中受阻大，常离开颗粒进入颗粒之外，也就是说，它们在胶颗粒内运行时间短，因此也被先洗脱下来。更小的分子在胶颗粒中运行距离长，停留时间也长，后于可进胶的大分子而依次被洗脱。最小的分子在胶颗粒中运行距离最长，停留时间也最长，最后被洗脱出来。最小分子的洗脱体积=V外+V内，（实际洗脱体积会更大些，因为蛋白质分子在Sephadex中除受分子筛效应外，还有一些空间的相互作用而影响洗脱体积）。（二）、注意事项：1.要根据所需纯化物质的分子量选择胶的孔径，见讲义。2.胶要充分澎涨，并去掉小颗粒。3.装柱要均一，胶面要平整，柱不能留有气泡（包括死空间）。否则得重装。4.装完后上样前要用洗脱液平衡2倍体积以上。5.要稳压，视所选择的胶的不同控制洗脱液排出口与洗脱瓶之间的高度差，并控制洗脱速度。6.使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再上柱使用。7.为防长霉，洗脱液要含0.1‰的叠氮钠。8.澎涨后的胶要长期保存，应放置于4℃冰箱，并含NaN3。9.需核酸蛋白质检测仪、部分收集仪和记录仪的使用说明书。（三）、所获的纯化蛋白质可继续研究的内容：1.通过生物质谱进行蛋白质的序列分析，并通过信息软件，了解该蛋白质的功能，与其他生物同类蛋白质进行比较，进行定量分析，大小，PI分析。2.若为酶类的蛋白还可以进行酶最适PH，温度，离子类型及浓度，抑制剂种类及最低抑制浓度分析，酶反应动力学研究，竞争抑制类型研究，化学修饰分析。（要求通过查阅资料进行实验设计）3.可以结晶进行园二色性，X光衍射，顺磁，核磁共振谱研究——三维结构研究。

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