05-1 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.pptx

第1页：实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

第2页：限制性内切酶

限制性内切酶：能够识别双链DNA上的特定位点并切开DNA，是基因操作不可缺少的工具酶。

第3页：EcoR I 识别序列

EcoR I Restriction Enzyme：识别序列为

------G↓AATT C------
------C TTAA↓G------

即在G与A之间切开，产生互补的黏性末端。

第4页：Hind III 识别序列

Hind III Restriction Enzyme：识别序列为

------A↓AGCT T------
------T TCGA↓A------

即在第一个A与第二个A之间切开，产生互补的黏性末端。

第5页：酶切反应条件

每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：

pH范围

7.5~8.0。

缓冲液组份

Tris（三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、MgCl₂、巯基乙醇。

温度

37℃。

第6页：琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固，会形成良好的电泳介质。

第7页：电泳的定义

电泳：在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。

第8页：琼脂糖浓度与分离范围

原文浓度数值与分离范围分行排列，此处已按浓度由低到高的对应关系还原为两列。

第9页：电泳试剂

TBE电泳缓冲液

45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0。

加样缓冲液

0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp）、0.25% xylene cyanol FF（天蓝色，2000bp）、40%蔗糖。

EB（溴化乙锭）染色液（有毒）

0.5μg/mL，用水配制。

第10页：溴化乙锭染色

• 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下发出桔红色荧光。
• 电泳结束后，将凝胶浸入0.5μg/mL的EB溶液中染色10min，在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般＞5ng。

第11页：操作步骤

操作步骤：酶切反应→制胶→点样→电泳→染色和观察。

第12页：酶切反应体系

第13页：制胶操作

1. 用电极缓冲液（0.5×TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL。
2. 称取0.14g琼脂糖，加20mL 0.5×TBE。
3. 微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解。
4. 冷却至60℃左右。
5. 准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固。

第14页：点样安排

第15页：电泳条件

电泳：接通电源，150V电泳0.5小时。

第16页：染色与观察

1. 切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟。
2. 取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型。

第17页：EB安全警告

警告

• EB诱变。
• 染色和观察时一定要戴手套！

第18页：电泳结果示意图

电泳结果示意（泳道1→4）：1 自提DNA；2 自提DNA／Hind III；3 λ-DNA／Hind III；4 λ-DNA。凝胶前方可见RNA条带，提示样品中残留RNA。

第19页：结果记录与分析

结果记录与分析：绘制电泳图谱，记录各泳道DNA条带的位置与数目。

第20页：λ-DNA/HindⅢ标准

• λ-DNA/Hind III Marker用Hind III彻底降解λ-DNA制得。
• 贮藏缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH7.5），10mol/L NaCl，1mol/L EDTA。

第21页：Marker片段大小与带型

原文片段数值连写为「23130 9416 6557 4361 2322 2027」，此处按λ-DNA/Hind Ⅲ标准片段大小拆分并按由大到小排列。