09-2 实验九 Western_blot的原理、操作.docx

第1页：原理与样品制备

实验九 Western blot的原理、操作及注意事项

原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针对靶物质进行检测。蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng（最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备 A：样品的制备

1 组织

组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W、6mins、0℃超声波破碎，5000rpm、5mins离心，取上清；加入β-ME（9.5mL加入0.5mL）、溴酚蓝（9.5mL加入0.5mL）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出直接溶解上样。

2 细胞

离心收集细胞或直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer收集，180W、6mins、0℃超声波破碎，5000rpm、5mins离心，取上清；加入β-ME、溴酚蓝煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出直接溶解上样。

3 分泌蛋白的提取（特例）

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作

1. 做胶前的准备：①检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子；②检查是否有新鲜足量的10%APS，没有立刻重配；③按待检测抗体对应的原始抗原的分子量大小计算胶浓度，并算出分离胶各组分用量。
2. 制胶、电泳：①装好架子；②按配方配制分离胶（单位mL，Total 8mL）：15%胶取4mL 2×Sep. buffer、1.2mL 30% Gel.sol、ddH₂O补足，10%胶取4mL 2×Sep. buffer、2.7mL 30% Gel.sol，7.5%胶取4mL 2×Sep. buffer、1.9mL 30% Gel.sol，三种胶均加8μL TEMED、80μL 10%APS；在胶上面加一层蒸馏水促进凝集。③待分离胶凝集后配制浓缩胶（Total 3.5mL）：3%胶取1.7mL 2×Stacking buffer、0.35mL ddH₂O、1.4mL 30% Gel.sol，加5μL TEMED、50μL 10%APS，倒好后插入预先准备好的梳子。

第2页：电泳注意事项与常见问题

1. 待胶凝集好后上样、电泳：上层胶用60~80V电压，当样品至分离胶时用100~120V电压，一般电泳时间在1.5小时左右。

B：注意事项及常遇到的问题

• 分离胶不要倒得太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。
• 上样蛋白量不应超过30μg/mm²（载荷面即胶槽宽×厚，如5mm×1mm胶槽载荷面为5mm²）。
• 凝胶通常在0.5~1h内凝集最好：过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂且电泳时容易烧胶；太慢则说明两种试剂用量不够或系统试剂不纯、失效。
• 混合搅拌速度太快会产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形；太慢则不均匀，特别是甘油。
• 电泳中常出现的现象：条带呈笑脸状（︶），原因是凝胶不均匀冷却、中间冷却不好；条带呈皱眉状（︵），可能是装置不合适，特别是凝胶和玻璃挡板底部有气泡或两边聚合不完全；拖尾，是样品溶解不好；纹理（纵向条纹），是样品中含不溶性颗粒；条带偏斜，是电极不平衡或加样位置偏斜；条带两边扩散，是加样量过多。

第3页：半干法转膜操作

三、转移：在电流作用下使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等；本实验选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其蛋白吸附、物理强度与化学兼容性更好，规格有Immobilon-P（0.45μm）和Immobilon-PSQ（0.2μm，用于MW＜20kDa）。

A 半干法：即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸吸附的缓冲液传导电流起到转移效果；电流直接作用在膜胶上，条件较严酷但转移时间短、效率高。

电流1~2mA/cm²，通常100mA/膜；实验条件可按目的蛋白分子大小与胶浓度并据实际情况调整。

1. 滤纸和膜的准备（电泳结束前20分钟应开始）：①检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制；②检查是否有合适大小的滤纸和膜；③将膜泡入甲醇中约1~2分钟，再转入transfer buffer中；④将靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer中。
2. 转移：①在电转移仪上铺好下层滤纸（一般用三层）；②将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上保持湿润；③将胶剥出，去掉stacking gel，小心移到膜上；④剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置；⑤将一张靠胶滤纸覆盖在胶上，倒上transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸；⑥装好电转移仪，选定所需的电流和时间；⑦转移过程中随时观察电压变化，如有异常及时调整。

• 滤纸、胶、膜之间的大小一般为滤纸≥膜≥胶。
• 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
• 因膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿，以后操作中膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
• 滤纸可重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，上下滤纸一定不能弄混；不能分辨时可将靠胶滤纸换新的。
• 转移时间一般为1.5小时（1~2mA/cm²，10% gel），可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

C 转移后效果的鉴定：①染胶——用考马斯亮蓝染色经destain脱色后看胶上是否还有蛋白；②染膜——可逆染液有ponceau-s red、Fast green FC、CPTS等，色素可洗掉供进一步分析；不可逆染料如考马斯亮蓝、india ink、Amido black 10B等染色后膜不能再用于分析。

第4页：封闭操作

四、封闭（block）：封闭是为了使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。

• 常用的封闭液有bovine serum albumin（BSA）、non-fat milk、casein、gelatin、tween-20等，本实验一般用non-fat milk。
• 在转移结束前配好5%的Milk（TBST溶解）。
• 转移结束后将膜放入milk中block（一定要放在干净的容器里，避免污染，且要足以覆盖膜），并清洗整理好用过的滤纸以便下次使用。
• Block 4℃ O/N，或RT 1小时。

第5页：孵育洗涤与显色

五、孵育一抗

1. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
2. 配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀释好抗体；如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。
3. 将稀释好的抗体和膜一起孵育，一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

• 为便于后面分析结果，一般选用已确定分子量大小且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

六、洗涤：用TBST先快速洗三次把milk尽快洗掉，然后5mins×5；洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗：孵育RT 1小时，一般采用HRP标记的二抗，稀释比例1:5000；二抗稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性结合。二抗的选择要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或抗羊的二抗，并根据显色条件选择HRP、AP或GOD酶链二抗或标记其他探针（如核素等）。

八、洗涤：用TBST先快速洗三次把milk尽快洗掉，然后5mins×5；洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤一定要干净。

九、显色（HRP酶）

增强化学发光法（ECL）

氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂；鲁米诺（luminol，5'-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。ECL底物中含有H₂O₂和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）作用下发出荧光。

DAB显色

DAB（3,3-二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物，该棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必须使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想；对于AP标记的二抗选用BCIP和NBT显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应生成不溶性黑紫色沉淀的强信号。

第6页：ECL与DAB显色步骤

ECL试验步骤

1. 将两种显色底物1︰1等体积混合（一般各1mL/membrane）。
2. 将混合物覆盖在膜表面1~2分钟，摇晃使均匀。
3. 用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4. 在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
5. 显影、定影。
6. 根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

• 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

十、分析结果及其判断：常见问题原因分析及处理方法见附录一、二；附录一 Troubleshooting Blotting Problems（P43－48），附录二 Western Blotting Troubleshooting Logic Tree（P390－394）。

附录三 试验中所用到的试剂和缓冲溶液

1. 5×Stop Solution（Sample buffer）pH6.7：Stock取9.5mL，加BME 0.5mL、溴酚蓝（或派洛宁）适量；配方含20% Glycerol、10% SDS、250mM Tris，总量100mL（SDS 20g或50g、Tris 15.14g、475.00mL）。
2. Gel solution（30% w/v acrylamide mix）：29.2% acrylamide 29.2g、0.8% bis-acrylamide 0.8g，总量100mL。
3. 2×Laemmli Separation Buffer：0.75M Tris-HCl、0.2% SDS、20% SDS 10mL、90.825g，总量1000mL，pH8.8。
4. 2×Laemmli Stacking Buffer：0.25M Tris、0.2% SDS、20% SDS 1g、15.14g，总量500mL，pH6.8。
5. 10×Laemmli Running Buffer：250mM Tris 60.55g、1.9M Glycine 285.27g、1% SDS 20g，总量2L，pH8.3。
6. Transfer Buffer：48mM Tris base、39mM Glycine、0.037% SDS、20% MeOH。
7. TBST：10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.2% Tween-20，pH7.4（Tris 2.93g、NaCl 5.81g、Tween-20 0.375g，总量1000mL）。
8. Coomassie Stain：40% MeOH、10% HAc、0.1% BBR（Brilliant Blue R 1g，总量1000mL）。
9. Destain：30% MeOH 300mL、7.5% HAc 75mL，总量1000mL。
10. 10×丽春红染液配方：丽春红2g、磺基水杨酸30g、三氯醋酸30g，总量100mL。

第7页：DAB显色液配制

11）DAB

DAB

50mg。

0.05mol/L TB（pH7.6）

100mL。

30% H₂O₂

30~40μL。

先配成2~5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存；H₂O₂在工作液中终浓度为0.01%。