06-1 实验六 酵母醇脱氢酶的提取与纯化.pptx

第1页：实验六 酵母醇脱氢酶的提取和纯化

酵母醇脱氢酶的提取和纯化

实验目的：掌握蛋白质提取、纯化、浓度测定和酶活性测定的原理和方法。

第2页：实验原理

实验原理：分离纯化用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提取一定纯度的醇脱氢酶。

第3页：醇脱氢酶催化的反应

醇脱氢酶可催化醇和醛之间的氧化还原反应，辅酶是NAD⁺/NADH：

CH₃CH₂OH＋NAD⁺ ⇌ CH₃CHO＋NADH＋H⁺

乙醇过量时，NAD⁺被还原成NADH的速度与酶活力成正比，NADH在340nm有较强吸收，可通过测定单位时间内NADH的生成量确定酶活力。

第4页：实验步骤

实验步骤：一、提取纯化酵母醇脱氢酶——（一）粗提、（二）热变性去除杂蛋白、（三）有机溶剂沉淀杂蛋白、（四）有机溶剂沉淀酶蛋白。

第5页：一、粗提

1. 称酵母粉2g，置研钵中，加半勺石英沙和Na₂HPO₄溶液5mL，用力研磨10分钟。
2. 转入50mL离心管，用20mL Na₂HPO₄溶液洗研钵，洗液一并转到离心管中。
3. 摇匀，静置5分钟，5000rpm离心5min。
4. 取上清液，量取体积V₁。
5. 取2个1mL分别于1.5mL离心管中，4℃保存（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）。
6. 剩余的上清继续下一步纯化。

第6页：二、热变性去除杂蛋白

1. 剩余的上清在55℃保温15min，间歇搅拌。
2. 冰浴冷却，5000rpm离心5min。
3. 取上清，量体积V₂。
4. 取2个1mL分别于1.5mL离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），4℃保存备用。
5. 剩余上清置冰浴中。

第7页：三、有机溶剂沉淀杂蛋白

1. 将置于冰浴中的上清，加上清体积一半的预冷丙酮，混匀。
2. 4℃静置5min，5000rpm离心5min。
3. 取上清，量体积V₃。
4. 取2个1mL分别于1.5mL离心管中，4℃保存备用（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）。
5. 剩余上清倒入已置于冰浴中的50mL离心管。

第8页：四、有机溶剂沉淀酶蛋白

1. 在上清中按100mL加55mL丙酮的比例，加入预冷丙酮，混匀，静置5min。
2. 4℃，5000rpm离心5min。
3. 弃上清，沉淀溶于5.0mL 0.01mol/L K₂HPO₄中，体积为V₄。
4. 取2个1mL分别于1.5mL离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）。

第9页：酶活力测定方法

1. 将前面保存的上清用0.01mol/L K₂HPO₄稀释：第一步、第二、三、四步的酶液各稀释10倍备用。
2. 准备5只试管，编号1~5，加入以下四种试剂。

第10页：蛋白质含量测定（Bradford法）

• 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收波长在595nm，在0~100μg/mL范围内吸光度与蛋白质含量成正比。
• 蛋白质与G-250反应在2min内达到平衡且稳定，可检测微克级的蛋白质。

第11页：蛋白质标准曲线制作

取6个PA瓶配制0~100μg/mL蛋白液各1.0mL，加5.0mL G-250试剂，混匀放置2min，在595nm比色，绘制标准曲线。原文按管号6至1倒序排列且标签与数值错位，此处已按0~5管号升序还原。

第12页：样品蛋白浓度测定

1. 将样品提取液稀释50倍（参考值）。
2. 吸取1.0mL放入PA瓶，加5mL G-250试剂，混匀，放置2min。
3. 在595nm比色，记录吸光度值。
4. 通过标准曲线查得蛋白质含量。

第13页：纯化计算结果表

表中 C＝A×B（蛋白浓度×总体积），E＝A×D，F＝D/B（或E/C）；回收率以各步总活力与粗提总活力之比计算。

第14页：回收率与比活力公式

总活力

总活力＝活力单位数/mL酶液×总体积（mL）。

比活力

比活力＝活力单位数/mg蛋白＝总活力／总蛋白（mg）。

酶的回收率

回收率＝（某步总活力／粗提总活力）×100%。

第15页：实验材料试剂和器材

材料

酵母。

试剂

3.0mol/L乙醇、0.06mol/L焦磷酸钠（pH8.5）、0.0015mol/L NAD⁺、0.01mol/L K₂HPO₄、丙酮（预冷）、0.066mol/L Na₂HPO₄。

仪器

离心机、可见光分光光度计、紫外光分光光度计、水浴锅。

第16页：仪器和试剂

仪器和用具

可见分光光度计、1.0mL加液器、200μL加液器、10mL PA瓶。

标准蛋白质

牛血清白蛋白100μg/mL。

考马斯亮蓝染液

100mg G-250溶于50mL 90%乙醇，加85%（W/V）磷酸100mL，用水定容到1000mL。

第17页：试剂配制