05-2 实验五 DNA的限制性酶切和电泳.docx

第1页：酶切与电泳原理

实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳

一、实验目的

掌握DNA的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术。

二、实验原理 1、DNA的限制性酶切

限制性内切酶能够识别双链DNA的特定位点并切开DNA，该位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段；绝大多数限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列，如EcoRI识别G↓AATTC、BamHI识别G↓GATCC、HindIII识别A↓AGCTT。每种酶都有特定的pH范围、缓冲液组分与温育温度，一般37℃、pH7.5~8.0对大多数酶适合，典型缓冲液组分有Tris、NaCl、MgCl₂和巯基试剂。典型反应体系包括1μg或更少的DNA和1单位酶，总体积通常控制在20~50μL，反应时间1小时，加入EDTA可螯合金属离子终止反应。

2、DNA的琼脂糖电泳

DNA电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。pH8.0~8.3时核酸分子带负电，由负极向正极移动；以适当浓度凝胶为支持物，在分子筛作用下使大小和构象不同的核酸泳动率产生差异。琼脂糖电泳所需样品量仅0.5~1μg，可分离200bp至50kb的DNA；分离5~500bp小片段需用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨力极高，能分离相差1bp的片段。电泳后可用荧光染料EB染色，EB嵌入碱基对之间在紫外激发下发出红色荧光，少至1~10ng的DNA条带即可检出。

第2页：试剂与操作方法

试剂

1. 1×TBE电泳缓冲液：45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0。
2. 加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。
3. λ-DNA和提取的DNA：λ-DNA是λ噬菌体的基因组DNA，全长50kb，用HindIII或（和）BamHI酶切得到的片段被广泛用作DNA电泳的分子量标准。
4. 分子量标准（λ-DNA/HindIII）。
5. 限制性内切酶。

操作方法 1、DNA的限制性酶切

1. 取1只0.5mL离心管，按下列顺序加入：5μL DNA、2μL 10×buffer、12μL蒸馏水、1μL限制酶。
2. 轻轻摇匀，置于37℃保温1小时。
3. 加入4μL加样缓冲液，摇匀。
4. 取10μL进行电泳。

2、DNA的琼脂糖凝胶电泳

1. 将电泳槽彻底洗净，置于平整台面上并调节水平。
2. 用2%琼脂糖封固胶模边缘，任其凝固。
3. 配制1×TBE电泳缓冲液。
4. 用1×TBE电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使之溶解。
5. 待琼脂糖溶液冷至60℃时缓缓倒入胶模，厚约0.5mm。
6. 立即插入梳子，静待琼脂糖凝固。
7. 去掉封固的有机玻璃封条，将胶模放进电泳槽。
8. 向电泳槽倒入1×TBE电泳缓冲液，没过凝胶5mm。
9. 小心地拔掉梳子。
10. 用20μL的枪吸取DNA溶液，缓缓注入点样孔。

第3页：结果记录与思考题

1. 按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次点样。
2. 接通电源，电泳。
3. 电泳完毕，取出胶模，将胶置入EB染色液中染色10min。
4. 用搓板取出胶，置于紫外灯下观察。

3、结果记录与分析：绘出电泳图谱或照相，如果可能的话作出分子量与迁移率的关系图。

思考题

1. 加样缓冲液的作用是什么？
2. 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和适用范围有什么异同？