第1页：实验十ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离DNAf
实验十ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离DNA fragment recovery from theagrose gel
第2页：一、实验目的
- 一．实验目的及背景
- 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开，这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.
第3页：从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有
- 从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有：
- 电洗脱法
- 低熔点琼脂糖凝胶法
- ＤＥＡＥ滤膜插片法等
- 其中电洗脱法，经济节省，操作方便，对ＤＮＡ的回收效果好。
第4页：低熔点琼脂糖凝胶法
- 低熔点琼脂糖凝胶法
- 65oC琼脂糖凝胶熔点
- 低熔点琼脂糖凝胶37oC液体
第5页：ＤＥＡＥ滤膜插片法
- ＤＥＡＥ滤膜插片法
- High efficient
- DNA high quality for microinjection
- <5kb fragment
- 100ng DNA fragment
- 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes
- 0.5 mol/L NaOH 5 minutes
- 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
- 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
第6页：电洗脱法基本原理
- 电洗脱法基本原理
- 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。
- 取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。
第7页：二．实验试剂及仪器
- 二．实验试剂及仪器
- NaHCO3 2%
- EDTA-Na2 0.01M
- TBE电泳液10.8g Tris碱0.93g EDTA5.5g硼酸调pH8.2定容1000ml琼脂糖透析袋ＴＥ酚氯仿乙醇
第8页：三、实验方法
- 三、实验方法
- 一、透析袋的处理：
- １．切取适当长度适析袋。
- ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸１０分钟。
- ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。
第9页：二、电洗脱
- 二、电洗脱
- １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。
- ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。
- ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行），加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。
- ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。
- ５．改变电场方向继续通电１分钟。
- ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中。
第10页：７．加入１．５倍体积正丁醇
- ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。
- ８．在台式离心机上最高速２分钟。
- ９．吸去上层，正丁醇溶液。
- １０．重复７，８，９二次。
- １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。
- １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。
第11页：１３．12000g，4℃下离心１０分钟
- １３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。
- １４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。
- １５．加入５０μlＴＥ溶解ＤＮＡ。
- １６．取１０μlＤＮＡ溶液加入2μl Loading buffer于０．８％琼脂糖上，４０伏电泳，３小时。
- １７．在紫外透射仪上观察结果。
- １８．测定ＤＮＡ溶液OD260,OD280值。
第12页：结果与分析
- 结果与分析
- １．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。
- ２．记录电泳结果
- 问题与讨论：
- １．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？
- ２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？
第13页：玻璃奶法快速纯化回收DNA片段本方法有多
- 玻璃奶法快速纯化回收DNA片段本方法有多种用途，主要包括：
- 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段；
- 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；
- 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；
- DNA浓缩、去盐及去除杂质。
- 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。
第14页：使用本法回收DNA片段有以下优点
- 使用本法回收DNA片段有以下优点：
- 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；
- 简便：所需主要仪器是一架台式离心机；
- 快速：整个回收过程只需半个小时；
- 高效：回收得率达到70%以上；
- 多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；
- 安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。
第15页：实验加样表
二、试剂盒组成 1．碘化钠溶液：50ml 2．DNA洗涤液（20倍浓缩液）：10ml 3．“基因纯”试剂：1ml 4．超纯水：1ml 使用前，将DNA洗涤浓缩液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于-20℃冰箱中，其余溶液置于4℃冰箱。
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第16页：三、操作步骤
- 三、操作步骤
- 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段
- a.常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭（EB）染色DNA，而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来，置于一1.5ml离心管中。
- b.称出凝胶带的重量，加入三倍量（V/W）的碘化钠溶液。（如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液）。
- c.置于55℃水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。
- d.加入20ul充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟），室温放置5分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。
第17页：e.离心10秒（10,000rpm）
- e.离心10秒（10,000rpm），倒去上清液。
- f.加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液，充分摇匀，离心10秒，去上清。
- g.重复步骤f两次（共洗涤三次）。
- h.用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。
- i.加入20ul超纯水，混匀后置于55℃水浴5分钟。
- j.离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。
第18页：注意事项
- 注意事项：
- 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。
- DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。
- 步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。
第19页：PCR反应物中纯化目的DNA片段
- PCR反应物中纯化目的DNA片段
- PCR反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。
- 加入300ul碘化钠溶液，混匀。
- 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。
第20页：从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小
- 从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段
- 探针制备反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。
- 加入300ul碘化钠溶液，混匀。
- 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。
第21页：DNA浓缩，去盐及去除杂质
- DNA浓缩，去盐及去除杂质
- 加入3倍量的碘化钠溶液于样品DNA溶液中（若DNA为固态，则先将之溶于适量水或TE中，再加3倍体积的碘化钠溶液）。
- 加20ul或更多的“基因纯”试剂（每ul该试剂可吸附0.3ugDNA，操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量，但不应少于10ul）。
- 以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。
