页数：26页文件大小：15.43 MB来源： 现代生物学实验ppt课件
本课件为《现代生物学实验》的实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定部分，系统梳理本实验的主要内容，并说明目的要求、原理、试剂器材、操作步骤与注意事项，便于课前预习和实验现场对照操作。
实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定
一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。
二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1．原理
2．主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值纯DNA
（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1．原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-[S]曲线v[S]推导出米氏方程为：其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
四、分光光度计的使用
1．722型分光光度计的外形
2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长
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对硝基苯酚标准曲线加样表：下表依据源文件文字按原课件列序还原，供对照操作与记录结果使用。
| 管号 | pNP含量（μmol） | 0.5μmol/mL pNP（mL） | H2O（mL） | Na2CO3-NaHCO3（mL） | 20mmol/L MgCl2（mL） | 0.1mol/L NaOH（mL） | OD405nm |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 | 0.8 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 1 | 0.05 | 0.1 | 0.7 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 2 | 0.10 | 0.2 | 0.6 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 3 | 0.15 | 0.3 | 0.5 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 4 | 0.20 | 0.4 | 0.4 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 5 | 0.25 | 0.5 | 0.3 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
| 6 | 0.30 | 0.6 | 0.2 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 待测定 |
说明：源文件此表为压平文本，上表按原课件列序推断还原；原文「0号一支，1－7号各二支」与表头管号 0—6 的标注不一致，建议对照原课件图片核对。
(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No. 1 2 3 4 5底物终浓度[S] (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5310 mmol/L pNPP（mL）0.1 0.15 0.2 0.3 0.6蒸馏水（mL）0.5 0.45 0.4 0.3 0碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0 mL20 mmol/L MgCl2（mL）各加0.2 mL预热混匀，37℃，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2 mL酶液反应时间37℃，精确反应10分钟0.1 mol/L NaOH（mL）各加2 mL酶液（mL）空白管各补加0.2 mL酶液OD405
本页含表格，源文件仅提取到压平文本（无分隔符），行列结构已破坏，暂无法安全还原，建议对照原课件图片补录表格。
（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量( mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。
本页含表格，源文件仅提取到压平文本（无分隔符），行列结构已破坏，暂无法安全还原，建议对照原课件图片补录表格。
六、注意事项1.取液量一定要准确。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定OD405时要以各自的空白调零点。6.移液管或取液器的使用7.比色杯的使用
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5'54'43'32'21'1管号54.543.532.521.510.5加酶时间（min）1514.51413.51312.51211.51110.5加NaOH时间10101010101010101010反应时间（min）返回
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七、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？
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