第1页：实验基本技术分子生物学部分
实验基本技术分子生物学部分
第2页：存在问题
- 存在问题
- 1.基本的实验技能
- 2.实验习惯
- 3.责任感和安全性
第3页：核酸纯化技术
- 核酸纯化技术
- 离心分离技术
- 凝胶电泳技术
- 核酸定量技术
- 分子杂交技术
- 序列分析技术
- ………………
第4页：一核酸纯化技术
一核酸纯化技术
第5页：原理、1.核酸混合物成分
- 原理
- 1.核酸混合物成分:结构类-细胞碎片，细胞器，其他大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等
- 2.关键:DNA，RNA—Protein
- 3.方案：Protein变性苯酚：强变性25氯仿：弱变性24异戊醇：消泡1
第6页：苯酚的处理：重蒸-饱和-pH重蒸
4.苯酚的处理：重蒸-饱和-pH重蒸：去除醌类氧化物饱和：防止核酸损耗pH：pH7.0-8.0-核酸最适合方法：蒸馏（183℃）-收集（棕色瓶）-饱和与调pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1%8羟基喹啉-4℃或-20℃保存
第7页：方法样品+等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀
方法样品+等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡离心（12000*g）取上清
第8页：核酸相Protein变性相有机相
核酸相Protein变性相有机相
第9页：二离心技术
二离心技术
第10页：原理、离心力：F=ω2rmRCF=F/G
- 原理
- 离心力：F= ω2rmRCF=F/G= ω2r/g=（2π * rpm）2r/g=1.119*10-5(rpm)2r
- 浮力密度：K=m-mp0/p
- 沉降阻力：f*(dx/dt)
- RCF=k+ f*(dx/dt)差速离心—密度梯度离心
第11页：操作、离心机分类：普通6000rpm高速
- 操作
- 离心机分类：普通6000rpm高速20000-25000rpm超速30000-80000rpm
- 平衡
- 温度-离心力-转速
- 转头：角转，平转，垂直转
第12页：三凝胶电泳技术
三凝胶电泳技术
第13页：原理、等电点：DNApI=6.0-
- 原理
- 等电点：DNA pI=6.0-7.0
- 琼脂糖-PAG：支持介质
- U=V/E=（d/t）/（v/l）=Q/(6 π rη)
第14页：电泳影响因素
- 电泳影响因素
- 1. DNA物理性质质粒：CC＞L＞OC线形：㏒10M正比1/m
- 2.介质性质㏒10U=㏒10U0-KrT分离范围：agrose：100bp-60kbPAG：5-500bp
- 3.电压：5v/cm
- 4.缓冲液：TAE，TBE，TPE
第15页：四核酸定量技术
四核酸定量技术
第16页：原理、A=㏒10（1/T）=abc
- 原理
- A=㏒10（1/T）= abc
- 浓度：稀溶液（A-0.05-1.0）+b=1cmDNA：1OD260=0.05ug/ulRNA：1OD260=0.04ug/uldsDNA：1OD260=0.033ug/ul
- 纯度：OD260/OD280=1.6-1.8
第17页：五分子杂交技术
五分子杂交技术
第18页：六序列分析技术
六序列分析技术
第19页：作业、1.市售苯酚为什么要饱和与重蒸
- 作业
- 1.市售苯酚为什么要饱和与重蒸？
- 2.离心操作应该注意哪些问题？
- 3.如果要分离470bp和5kb DNA应该选择什么凝胶？
- 4.在核DNA定量时，取10uL DNA待测液，用TE buffer稀释到100uL后，加入到0.5cm的石英比色皿中。OD260测定为0.21，问DNA待测液的浓度是多少？
- 5.简述DNA序列分析的基本原理。
第20页：任务、采集植物叶片
- 任务
- 采集植物叶片
- 1.植物的科,种,属
- 2.取幼嫩叶片0.8克(中午)
- 3.清洗干净,擦干水分!?
