06 实验六 聚合酶链式反应（PCR）技术.ppt

第1页：聚合酶链式反应（PCR）技术

实验名称

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术

所属课程

分子生物学实验

第2页：实验六内容目录

本实验内容

• 实验目的
• 实验原理
• 实验仪器、材料与试剂
• 实验步骤
• 实验结果及讨论

第3页：实验六 实验目的

• 掌握 PCR 反应的原理及技术。

第4页：PCR技术原理概述

PCR技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称 PCR，是一种体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝，在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛应用。

反应本质

在模板DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应；其特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

第5页：PCR：变性－退火－延伸

PCR：变性 → 退火 → 延伸

本页为PCR循环三步的标题图示页，标示一次循环由变性、退火、延伸三个阶段构成。

第6页：PCR 循环示意

本页为PCR循环示意图，展示模板DNA、引物与新合成链在循环中的对应关系。

第7页：靶DNA扩增过程示意

本页为靶DNA扩增过程示意图，展示引物 1、引物 2 与模板链结合及新引物延伸，形成单位长度的链与不同长度的链。

注：本页图形中的文字与标注在源文件中分离，提取后仅余 5′、3′、引物 1、引物 2 等片段字符，建议对照原图核对。

第8页：PCR反应的三个步骤

1. 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；
2. 退火：当温度突然降低时，引物与其互补的模板在局部形成杂交链；
3. 延伸：在DNA聚合酶、dNTPs 和 Mg²⁺ 存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。

以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，数量可达 10⁶～10⁷ 个拷贝。

注：原文「~106~7」为上标丢失的排印形式，此处按 10⁶～10⁷ 个拷贝释出。

第9页：PCR反应的七个参数

PCR技术的参数主要有 7 个

• 聚合酶
• 引物
• dNTPs
• 反应 buffer
• 二价离子
• 模板
• 一价离子

第10页：实验六 实验仪器

（一）仪器

• PCR仪
• 台式离心机
• 微量取液器

第11页：实验六 实验材料

（二）材料

• 模板DNA。

第12页：实验六 试剂与引物

（三）试剂

• 10× PCR buffer；
• dNTPs 2.5 mM；
• Taq 酶 5 U/μl；
• 引物 1 和 2（2 μmol/L）（T3、T7）；
• 模板。

第13页：50μl PCR反应体系

实验步骤

在 0.2 ml Eppendorf 管内配制上述 50 μl 反应体系。

第14页：PCR循环程序

第15页：扩增产物的电泳检测

3. 扩增结束后取 50 μl 扩增产物，利用琼脂糖电泳检测DNA扩增情况，并切胶用于回收。

第16页：实验六结果及讨论

实验结果及讨论

• PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带；
• 如退火温度过低，也可能出现杂带。

第17页：PCR产物凝胶电泳结果

本页为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图，泳道自左至右编号为 1～13，末端为 DNA Marker（M）泳道。

第18页：

第19页：PCR引物设计要点

PCR引物设计

• 长度：互补序列大于 20，没有上限；
• 两引物具有较好的协调性；
• 内部二级结构较少；
• 加酶切位点时需要注意保护碱基长度；
• 检测特异性；
• 大引物与定点突变；
• 3′端绝对不能互补。

第20页：胶回收试剂盒制品说明

制品说明

用途

本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。

原理与特点

采用独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需 30 分钟便可完成。

回收量

每次可纯化得到多至 10 mg 的DNA片段（100 bp～30 kbp），回收率高达 50%～80%。

适用范围

回收的DNA片段纯度高、完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

每次处理的胶块量约为 300 mg 时，本试剂盒可使用 50 次。

注：原文回收量记为「10 mg」，按其适用的 100 bp～30 kbp 片段回收规模，常见规格为 10 μg，此处保留原文数值供核对。