31 实验十 补体结合反应.doc

第1页：实验十 补体结合反应

• 实验十补体结合反应目的要求
• 1.以鼻疽补体结合反应为例，了解补体结合反应术式的基本环节
• 2.能独立运用本血清学反应的知识，作血清学检验
• 操作步骤
• 一、材料准备
• 一）溶血素从兽医生物药品厂购买，保存于冰箱中，有效期1年以上，1月之内效价变动不大，1月可以测一次效价
• 二）补体从兽医生物药品厂购买冻干补体，保存于冰箱，效价可半月测一次
• 也可以采3～4只成年雄性豚鼠血，分离血清，混合，保存于冰箱或冷处，24小时内应用
• 若检查材料多，需大量补体时，不从心脏采血，可由颈动脉放血于培养皿中，待血液凝固后移于冰箱次晨分离血清
• 如当日采血可直接离心分离血清
• 将混合的新鲜豚鼠血清，加入NaCl达10％，置于冰箱或冷处，保存期可达数日或1周
• 三）绵羊颈静脉采血，盛于预先加玻珠的玻璃瓶中（或加有5％柠檬酸钠水溶液的玻瓶中），然后，将血分盛于离心管中，以每分钟1500～2000转离心10～15分钟，使红细胞下沉，吸弃上清液，加3～4倍生理盐水混合，再次离心，每分钟1500转15分钟
• 这样经第三次洗涤后，吸弃上清，将下沉的红细胞配成
• 2.5％红细胞悬浮液（或临用前配制）
• 配制好的红细胞下沉液置5～10℃下保存，24小时内可应用
• 若发现溶血时需重新配制
• 四）鼻疽抗原
• 五）标准血清
• 六）被检血清从兽医生物药品厂购买
• 鼻疽阴、阳性血清由兽医生物药品厂购买
• 采取被检动物血清
• 分离血清后，用生理盐水稀释10倍，加热灭能，以破坏其中补体和其中可能含有的抗补体物质
• 马血清加热至58～59℃，维持30分钟，骡驴血清加热至63～64℃，维持40分钟
• 七）生理盐水蒸馏水中加入
• 0.85％化学纯氯化钠，经灭菌后使用
• 二、预备试验
• 一）溶血素滴定将溶血素在水浴箱中加热至56℃、30分钟灭能
• 用生理盐水配成1:100的基础稀释液
• 0.1ml溶血素加入生理盐水
• 9.9ml），取10个试管，按表10-1作各种稀释度（1:1000～1:5
• 0）
• 然后另取13支试管，按表10-2加入各成分
• 1、12和13管分别为溶血素、补体与生理盐水对照管
• 摇振均匀，置37℃水浴箱中，10分钟后取出观察结果：若1～7管红细胞完全溶解，8管部分溶解，9～13管不溶解
• 溶血素的效价为1:3000，即能使红细胞完全溶解的最小溶血素量，称为溶血素的效价，亦称为一个单位
• 当补体滴定、抗原滴定、正式试验时，均用两个单位的溶血素（减少1倍稀释）
• 二）溶血素补体滴定按表10-3加入各成分
• 混合后置37℃水浴箱中，10分钟后取出检查结果
• 补体、溶血素、生理盐水三个对照管均为不溶血（表10-3中
• 2、
• 3、14管）
• 溶血系补体效价在有两个单位溶血素存在时，于37℃10分钟能完全溶解
• 2.5％绵羊红细胞
• 0.5毫升的最小补体量，为一个溶血系补体单位
• 溶血系补体效价为溶菌系补体测定提供用量的参考

第2页：101溶血素稀释表稀释度生理盐水

• 表10-1溶血素稀释表稀释度生理盐水（ml）溶血素基础稀释液（ml）管号1:10001:12001:15001:18001:20001:25001:30001:35001:40001:50000.91.11.41.71.92.42.93.43.94.90.10.10.10.10.10.10.10.10.10.112345678910表10-2溶血素滴定表生理盐水（ml）1:20补体（ml）2.5%血红球（ml）溶血素管号ml稀释度1.00.50.50.51:100011.00.50.50.51:120021.00.50.50.51:150031.00.50.50.51:180041.00.50.50.51:200051.00.50.50.51:250061.00.50.50.51:300071.00.50.50.51:350081.00.50.50.51:400091.00.50.50.51:5000101.5—0.50.51:100111.50.50.5——122.0—0.5——13（三）溶菌系补体滴定溶菌系补体滴定时，所用补体量系从溶血系补体单位的前一管开始。设溶血系补体单位为1:20补体0.16ml，则滴定溶菌补体时从0．13ml开始，如溶菌系补体滴定表10-4所示。溶菌系补体效价是在二单位溶血素存在的情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而阳性血清未加抗原及阴性血清不论有无抗原的试管发生完全溶血所需最少补体量，就是所测溶菌系补体效价。如表10-4中第五管1:20稀释的补体0.25毫升即为工作量补体。按下式计算，原补体在使用时应稀释的倍数：补体稀释倍数（滴定时用的）测得效价20按上公式计算为：0.25
• 0.5
• 40即此批补体应作1：40稀释，每管加0.5毫升为一个补体单位。×使用时每管加入量=原补体稀释倍数

第3页：抗原滴定滴定抗原时需用灭能的鼻疽两个

• 四）抗原滴定滴定抗原时需用灭能的鼻疽两个（强、弱）阳性血清与两个阴性血清，先将各种血清按血清稀释表分别做成1：
• 0、1：
• 5、1：
• 0、1：75和1：100的稀释
• 每一份血清的每一稀释度，都要按抗原滴定表表实10-6所示进行操作
• 一个抗原单位是在强阳性血清的最高稀释度中完全抑制溶血（即完全不溶血）、在弱阳性血清管中发生50％溶血，而在阴性血清管中完全溶血的最小抗原量
• 例如抗原滴定结果记录表见表10-7，抗原的效价为1:150
• 表10-3溶血系补体滴定表
• 2.5%血红球（ml）二单位溶血素（ml）生理盐水（ml）1：20补体（ml）管号
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• 0.5—
• 0.5—
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• 1.00——1234567891011121314表10-5血清稀释表稀释度生理盐水（ml）血清（ml）管号1：101:251:501:751:1
• 9.
• 9.
• 9.
• 4.8或
• 7.
• 9.
• 1.
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• 0.2或
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• 0.112345
• 五）正式试验正式试验需已知强阳性血清和已知阴性血清作对照
• 被检血清和溶血素、对照血清均应灭能，按补体结合反应正式试验表表实10-8操作
• 从预备试验到正式试验，所用的细胞、补体、抗原、已知阳性血清和已知阴性血清，都必须是同一批，决不能中途更换另一批，所用补体若为新鲜的豚鼠血清，则从预备试验到正式试验必须在24小时内做完，以免补体失效
• 每一份被检血清要作三管（表中的
• 1、
• 2、3管），其中1是正式试验管，
• 2、3为检验血清对照管
• 结果见表10-9

第4页：109

• 表10-9正式试验结果记录表结果是记录为溶血百分数强阳性反应阳性反应弱阳性反应可凝反应可凝反应阴性反应++++++++++±-0—10%10—40%40—50%50—70%70—90%90—100%第二次加温完毕后，取出立即作第一次观察
• 对照管与下所述完全相符，可作为正式试验的第一次观察
• 再置室温静置12小时后，作第二次检查，详细记录结果
• 为了正确判定反应结果，按下述方法配制标准比色管，以断定溶血之程度
• 标准比色管的制备
• 1.取离心沉淀的红细胞
• 1.25ml，加入蒸馏水
• 8.75ml，使红细胞完全崩解，再加入
• 0.85gNaCl，制成
• 1.25％生理盐水溶血液
• 2.取离心沉淀的红细胞
• 1.25毫升加入于
• 0.85％生理盐水
• 8.75ml中，制成l.25％生理盐红细胞悬浮液
• 3.按表实10-10加入各成份，即成不同溶血百分串的标准溶血管，并与正式试验管同时置室温12小时，然后与试验管比较
• 表10-10标准溶血管的制备表100%1190%1080%970%860%750%640%530%420%310%20%1溶血百分率及量管号成分
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• 0.5——1：10健马血清（ml）抗原一个单位（ml）溶血素二单位（ml）
• 1.25%生理盐水溶血液（ml）
• 1.25%红细胞悬浮液（ml）

第5页：104

• 表10-4溶菌系补体滴定表共同对照管血清对照管各列的试验管管用量号成分5432194939291876543
• 0.
• 1.0—
• 2.0—
• 1.
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• 1.5—
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• 0.371:20补体（ml）生理盐水（ml）各列的试验管均加—————————
• 1.0——————
• 1.0—
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• 0.51:10血清（ml）抗原（工作量）（ml）第一列阳性血清——————————————————
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• 0.51:10血清（ml）生理盐水（ml）第二列————————————
• 1.0—————
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• 0.51:10血清（ml）抗原（工作量）（ml）第三列阴性血情——————————————————
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• 0.51:10补体（ml）生理盐水（ml）第四列置37℃水浴锅中20分钟—
• 0.5—
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• 0.5—
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• 0.5溶血素二单位（ml）
• 2.5%绵羊红血球（ml）置37℃水浴锅中20分钟，观察结果#—#—#—#—#—#—#—#—#—#—#—#—#—#—#+#++#+++阳性第一列有抗原血清第二列无抗原——————————————————————————++++++++++++##阴性第三列有抗原血清第四列无抗原注：#：不溶血，+++：75%溶血；
• +：25%溶血，—：完全溶血

第6页：106抗原滴定表共同对照管

• 表10-6抗原滴定表共同对照管（只共同做一套）血清对照管（每一血清只做一个1：10的稀释度）抗原滴定（每一血清的各个稀释度都要做）管用量号成分654321
• 0）
• 9）87654321————1：101：10——1:5001:1001:3001:2001:1501:1001:501:10稀释度（ml）抗原————
• 0.
• 0.5——
• 0.
• 0.
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• 0.
• 0.
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• 0.
• 0.5——————
• 0.
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• 0.5稀释血清（ml）—
• 1.0—
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• 0.5—
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• 0.
• 0.5一个溶菌系补体单位（ml）
• 1.
• 0.
• 1.
• 1.
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• 1.0————————生理盐水置37℃水浴锅中20分钟——
• 1.
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• 0.5二单溶血素（ml）
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• 2.5%绵羊红血球（ml）
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• 0.5———
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• 0.5——
• 0.5—————生理盐水置37℃水浴锅中20分钟，取出检查，并记录结果需用试管数：抗原滴定管：有8个抗原稀释度，4个血清，每个血清有5个稀释度，共需8×4×5=160管
• 血清对照管：有2管4个血清，每个血清只用1个稀释度，共需2×4×1=8管
• 共同对照管：6管以上共需174管

第7页：共同对照管管号表107

• 共同对照管管号表10-7抗原滴定结果记录抗原滴定（每一血清的各个稀释度都要做）血清对照组1234567658
• 9）
• 0）12341：1：抗1：1：1：1：1：1：50150200300400500原10100稀释度强+++++++++阳性———+血清弱++++++###不不系素溶抗健血补全体无补体时无不不溶溶血血———##——#说说说说说说明明明明明明—#盐补溶溶抗抗水体血血原原不溶血阳1：性++++++10血清两########—#个阴性血清强——+++##说明血清本身不溶血说明血清不抗补体阳性——血清弱+++###阳1：性++++++++25血清两########个阴性血清强—+++++++##阳性—血清弱++++++####阳1：性++++50血清两########个阴性血清强++++++++++###阳性血清弱+++######阳1：性++75血清两个阴性血清########(无溶血素时)(无溶补血体素时时)

第8页：#####+++++++强阳性血清1

#####+++++++强阳性血清1：100#######+++弱阳性血清########两个阴性血清注：“—”完全不溶血，“+”25%溶血，“+++”75%溶血，“#”100%溶血

第9页：108

• 表10-8补体结合反应正式试验表各项对照管（无论是多少个被检血清都只做一套）被检血清管号及用途用量成分其他对照管阴性血清对照阳性血清对照被检血清对照管正式试验管151413121110987654321——————
• 1.
• 1.
• 0.
• 1.
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• 0.51：10血清（ml）一个抗原单位（ml）一个溶菌系补体单位（ml）生理盐水（ml）———
• 1.
• 1.0———
• 0.5——
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• 0.5——
• 1.0—
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• 0.5——置37℃水浴锅中20分钟
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• 0.5二单位溶血素（ml）
• 2.5%绵羊红血球（ml）生理盐水（ml）
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• 0.5——置37℃水浴锅中20分钟，取出检查，并记录结果#完全不溶血#完全不溶血#完全不溶血#完全不溶血—完全溶血—完全溶血#完全不溶血—完全溶血—完全溶血#完全不溶血—完全溶血#完全不溶血#完全不溶血—完全溶血各对照管应有结果（ml）