23 实验二 细菌抹片的制备及染色.doc

第1页：实验二 细菌抹片的制备及染色

• 实验二细菌抹片的制备及染色目的要求
• 1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法
• 2.认识革兰氏染色的反应特性
• 操作步骤染色是细菌学上一个重要而基本的技术
• 由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别
• 因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察
• 也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据
• 一、载玻片处理载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理
• 一）滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次
• 二）若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过
• 玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径
• 1.5cm的圆圈，用以标记
• 二、涂片方法
• 一）菌落涂片方法涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1～2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径
• 1.5cm的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成
• 二）菌液涂片法用灭菌接种环沾取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上,使成直径为
• 1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用
• 三）血液涂片方法先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用
• 四）组织涂片方法先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层
• 三、干燥涂片最好在室温中自然干燥
• 必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查
• 四、固定有两种固定方法
• 一）火焰固定将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰四次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度
• 放置冷却后，进行染色
• 二）化学固定血液、组织脏器等抹片作姬姆萨氏染色或单染色时，不用火焰固定而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3分钟，取出晾干；
• 或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3分钟后，自然挥发干燥，抹片作瑞特氏染色时则不必作特别固定，染色液中含有甲醇可以达到固定目的
• 抹片固定的目的是：
• 1.使菌体蛋白凝固附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉
• 2.改变细菌对染料的通透性，因活细菌一般不允许染料进入细菌体内

第2页：3．能杀死抹片中的部分微生物

• 3．能杀死抹片中的部分微生物
• 必须注意，在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分涂抹物冲掉
• 因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽胞的病原菌抹片和染色时，应严格处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播
• 五、几种常用的染色方法
• 一）单染色法只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法
• 美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染色液，经1～2分钟，水洗，沥去多余的水分，吸干或烘干（不能太热），然后镜检
• 二）复染色法应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法
• 染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用，染色后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分，可以呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法，抗酸染色法，瑞特氏染色法和姬姆萨氏染色法等
• 1．革兰氏染色法1在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1～2分钟，水洗
• 2加革兰氏碘液于抹片上媒染，1～3分钟，水洗
• 3加95％酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗
• 4加10倍稀释石炭酸复红液复染1～2分钟，水洗
• 5吸干或烘干，镜检
• 革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色
• 2．抗酸染色法1在已干燥，固定好的抹片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，将玻片置酒精灯火焰上缓缓加热，至产生蒸汽即止（不要煮沸），维持微微产生蒸汽，经3～5分钟，水洗
• 2用3％盐酸酒精脱色，直至标本无颜色脱出为止，充分水洗
• 3用美蓝染色液复染约1分钟，水洗
• 4吸干或烘干，镜检
• 抗酸性细菌呈红色，非抗酸性细菌呈蓝色
• 3.瑞特氏染色法抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或者看情况补充滴加，经1～3分钟，加约与染液等量的中性蒸馏水或磷酸盐缓冲液，轻轻晃动玻片，使与染液混匀，经3分钟左右，直接用水冲洗（不可先将染液倾去），吸干或烘干，镜检
• 细菌染成蓝色，组织、细胞等呈其他颜色
• 4.姬姆萨氏染色法1于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆萨氏染色液原液，即稀释成为常用的姬姆萨氏染色液
• 2抹片经甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量的染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟，或染色数小时至24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检
• 细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色
• 视野常呈淡红色
• 5．荚膜染色法
• 1）涂片、干燥同单染色法
• 2固定3水洗4染色5水洗滴加甲醇液于涂抹面上，固定2～3分钟
• 倾去甲醇液，用水轻微冲洗
• 滴加碱性美兰染色液数滴于涂抹面上，染色2～3分钟
• 倾去染色液，用水轻微冲洗
• 6）干燥，镜检菌体染成蓝色，荚膜染成粉红色或无色
• 荚膜染色的原理：荚膜染色主要用于炭疽杆菌病料的荚膜检查
• 因为炭疽杆菌荚膜系由d-谷氨酸组成的多肽所构成，而菌体的主要成分则为核蛋白，因二者着色力不同，染色水洗

第3页：则可把荚膜上一部分染料冲洗掉

• 后，则可把荚膜上一部分染料冲洗掉，颜色变淡，故显微镜检查时，在着色较深的菌体周围看到一圈呈淡紫色的膜，即荚膜
• 又因碱性美兰是一种多染性染料，故菌体染为蓝色，荚膜则染成淡蔷薇色
• 6．芽胞染色法1将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定
• 2将5％孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上
• 3用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料
• 加热时间从冒蒸汽时开始计算约4～5分钟
• 4倾去染色液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止
• 5用
• 0.5％沙黄水溶液复染1分钟，水洗
• 6干燥或烘干后，置油镜观察，芽胞呈绿色，菌体呈红色
• 7．鞭毛染色法之一1涂片取10～12小时的幼龄培养菌，用1％福尔马林水溶液制成菌液，在37℃温箱中固定24小时，涂抹于载玻片上
• 2自然干燥，不固定
• 3用下述染色液加温染色30秒到1分钟，然后静置1～2分钟
• 4染色液配制①
• 0.5％苦味酸水溶液（加温溶解后过滤）
• 1.0ml
• ②20％鞣酸水溶液（加温溶解，不过滤）
• 1.0ml
• ③5％钾明矾水溶液（加温溶解后过滤）
• 0.5ml
• ④10％复红酒精溶液（配制后7天过滤）
• 0.5ml
• 上述染色液在用前，按①、②、③、④的顺序混合后，即可使用（染色液现配现用）
• 4水洗、干燥、镜检
• 5结果菌体呈深红色，鞭毛呈淡红色
• 8．鞭毛染色之二1脱脂玻片的准备要用新的或表面没有磨损痕迹的玻片
• 先用洗衣粉煮10～15分钟，取出玻片用清水洗净，再放入洗涤液中浸泡24小时左右，取出后，用自来水和蒸馏水洗净，再用95％酒精脱脂，用火焰烧去酒精，即可使用
• 如不立即使用，可在脱脂后放于干净的盒中，或浸泡于95％酒精中，用前在火焰上烧去酒精，冷却后使用
• 2菌种最好应用有冷凝水的新制琼脂斜面接种，培养10～12小时应用
• 如所用菌种久未移植，最好在这种斜面上每天移植一次，连续移植2～3次后使用
• 3染色液的配制甲液：单宁酸FeCl3蒸馏水15％福尔马林1％NaOH5g
• 1.5g100ml
• 2.0ml
• 1.0ml配好后，当天使用，次日效果差，第3天则不好用
• 乙液：AgNO3蒸馏水2g100ml待AgNO3溶解后，取出10ml备用，再向余下的90mlAgNO3中滴入浓氨水，使之成为很浓的氢氢化银，再继续滴加氨水变为透明，直到重新形成的沉淀物又刚刚溶解为止
• 再将

第4页：备用的10mlAgNO3慢慢滴入

• 备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgN03，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止
• 如所呈薄雾不重，即可使用，此染剂可使用一周
• 如雾过重、则银盐被沉淀出，不宜使用
• 4）染色方法在载玻片一端加蒸馏水一滴，再用接种环钓取少量细菌于水滴中沾几下，将载玻片倾斜，使水滴流到另一端，然后将载玻片稍斜或平放，在空气中干燥后，在涂片上滴加甲液染色2～4分钟，用蒸馏水冲洗，将残水甩干，或用乙液冲去水后，再加乙液染色30～60秒钟，然后用蒸馏水冲洗，在空气中晾干，镜检
• 如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛来
• 如加乙液后，将载玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，则效果更好
• 9．立克次氏体染色法1涂片以病料制成涂片
• 2干燥、微加温固定
• 3染色分钟
• 4脱色5水洗6复染滴加
• 0.25％碱性复红水溶液（染色液调至pH
• 7.2～
• 7.
• 4），用滤纸过滤,染色4用
• 0.5％枸橼酸把多余的染色液洗脱掉
• 1％美兰水溶液复染数秒钟
• 7水洗、干燥、镜检
• 8结果立克次氏体呈红色，其他组织细胞呈蓝色
• 附常用染色液的配制
• 一、常用染料原液的配制将各种染料按下表配制成酒精饱和溶液即为染料原液，可长期保存，用时按配方稀释
• 表2-1染料原液配制表备注染料原液名称溶于100毫升95%酒精中的染料克数染料名称均贮存于褐色瓶中碱性复红原液结晶紫原液龙脂紫原液美兰原液沙黄原液
• 0.
• 0.
• 7.
• 2.
• 3.4碱性复红结晶紫龙胆紫美兰沙黄
• 二、常用染色液的配制
• 一）石炭酸复红液碱性复红原液5％石炭酸溶液1m19ml混合后滤过，贮于褐色瓶中备用
• 二）10倍稀释石炭酸复红液石炭酸复红液蒸馏水1ml9ml混合后，贮于褐色瓶中备用

第5页：碱性美兰液美兰原液1

• 三）碱性美兰液美兰原液1％氢氧化钾溶液蒸馏水3ml
• 0.1ml10ml混合后滤过，贮于褐色瓶中，放置时间越长，效果越好
• 四）草酸铵结晶紫液结晶紫原液10ml1％草酸铵溶液40ml混合后过滤，贮存于褐色瓶中备用
• 五）沙黄液沙黄原液lml蒸馏水9ml混合后过滤，贮存于褐色瓶中备用
• 六）石炭酸龙胆紫液龙胆紫原液lm15％石炭酸溶液9ml混合后过滤，贮存于褐色瓶中备用
• 七）福尔马林龙胆紫液龙胆紫1～5g福尔马林100ml溶解后过夜，用滤纸过滤，贮存于褐色瓶中备用
• 八）姬姆萨氏染色液取姬姆萨氏染色粉末
• 0.6g，加入50ml甘油中，置于55～60℃水浴箱中2小时后，加入甲醇50ml，静置一日以上过滤后即可应用
• 九）瑞特氏染色液取瑞特氏染色剂粉末
• 0.1g加于乳钵内，加纯粹白色甘油
• 1.0ml研磨均匀，再加入中性甲醇60ml，使其溶解后，置于棕色瓶中7天后过滤，装于棕色瓶中，保存于暗处
• 该染色液保存时间愈久，染色之色泽愈鲜
• 三、媒染剂的配制以革兰氏染色中所用的媒染剂——革兰氏碘液为例介绍如下：碘化钾2g、碘1g、蒸馏水300ml，先将碘化钾溶于30ml蒸馏水中，待完全溶解后再加入碘，最后将蒸馏水加到全量（300ml）即成