30 实验九 沉淀反应.doc

第1页：实验九 沉淀反应

• 原
• 如实验九沉淀反应目的要求
• 1.了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义
• 2.初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法
• 原理将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应
• 参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素
• 沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原，以诊断传染病
• 但也用于以已知的抗原测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病
• 操作步骤
• 一、环状沉淀反应（以炭疽为例）将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上，在两液交界处发生环状的白色沉淀物，即称为环状沉淀反应
• 炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里（Ascoli）氏反应
• 具体操作方法如图实9-1所示
• 一）沉淀原的制备
• 1.热浸法取被检材料（如各种实质脏器、血液、渗出液等）1～3g，在乳钵内研碎，然后加5～10倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸15～30分钟，用中性石棉过滤，获得的透明滤液，即为被检的沉淀果过滤液混浊不透明，可再过滤—次
• 2.冷浸法用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌30分钟，以保证检查者的安全
• 然后取被检材料1g，浸于5～10倍的
• 0.5％石炭酸生理盐水中，在室温下或普通冰箱浸泡14～20小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原
• 二）方法与判定用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的1/3高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血清上面，达到试管的2/3高处（注意！不要发生气泡或摇动）
• 直立静置，在1～5分钟内，两液面交界处若出现清晰、整齐的环状白轮，则为阳性
• 为了验证反应的正确性，检验时可做如下三种对照试验；
• 1.炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀原，应为阳性；
• 2.标准炭疽沉淀原加健康马血清，应为阴性；
• 3.生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为阴性
• 二、琼脂扩散沉淀反应（以炭疽为例）抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具有特异性，则在—定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线
• 此种反应为琼脂扩散沉淀反应
• 由于一种抗原可能含有数种抗原成分，因而在凝胶中的扩散速度也不一样，所以在凝胶中可以和抗血清形成数条沉淀线，每一条沉淀线即代表一种抗原成分
• 所以琼脂扩散反应除

第2页：用作微生物的鉴定

• 用作微生物的鉴定、疾病诊断外，还可用作抗原成分的分析
• 该反应的操作方法如下：
• 一）琼脂凝胶的制备
• 1.取精制琼脂干粉1～
• 1.2g，放入100ml含1／万硫柳汞的磷酸缓冲液（PBS）或硼酸缓冲液（BBS）中，水浴加热融化混匀
• 2.融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质
• 3.将直径90mm的洁净平皿放在平台上
• 每平皿倒入热的琼脂15～18毫升，厚度约
• 2.5mm左右
• 注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中可保存2周左右
• 4．将琼脂平皿放于事先绘制好的图案上，用打孔器照图案打孔，外周孔径为6mm，中央孔径为4mm，孔间距3mm，见图9-2
• 三）加样与判定打孔后用琼脂写字墨水，在琼脂板上端写上日期及编号等
• 在中央孔加入标准炭疽沉淀原，在外周孔
• 1、
• 2、
• 3、4，各加炭疽沉淀素血清至孔满为止
• 待孔中液体吸干后，将平皿倒置以防水分蒸发；
• 将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中，置15～30℃室温或37℃恒温箱中，24小时后，即可出现较粗的白色明显的沉淀线
• 若用琼脂扩散反应诊断传染病，则是往中央孔滴加被检血清1滴（约
• 0.025～
• 0.05ml），在周围孔滴加不同浓度的抗原各1滴，放湿盒中静置于室温下或37℃恒温箱中2～5天，观察结果
• 若阳性反应，则在抗原与抗体孔之间出现1～2条或多条白色沉淀线
• 阴性者，则无白色沉淀线
• 图9-2琼脂扩散反应图