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第1页：实验八 凝集试验

• 实验八凝集试验目的要求
• 1.熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定
• 2.了解间接血凝反应试验过程和操作方法
• 操作步骤
• 一、平板凝集反应（以布氏杆菌为例）
• 一）取洁净玻片一块，用玻璃铅笔划成五行小格，并标明待检血清的号码
• 三）按表8-1滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中，加入煌绿及结晶紫制成）和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用12％浓盐水）
• 血清用前需放室温，使其温度达20℃左右
• 表8-1布氏杆菌的平板凝集反应对照试验组成分43
• 0.03————盐水—
• 0.
• 0.
• 0.
• 0.08被检血清
• 0.
• 0.
• 0.
• 0.
• 0.03抗原
• 三）用火柴棒自血清量最少格起,依次往前搅拌，使血清与抗原混匀，每份血清用一根火柴棒
• 四）混合完毕后，将玻片置于凝集反应箱上均匀加温，或放于离火焰稍高处，微微加温至30℃左右，3～5分钟内记录反应结果
• 五）按下列标准记录反应强度++++：出现大的凝集块、液体完全透明
• +++：有明显凝集块、液体几乎完全透明，即75%凝集
• ++：有可见凝集片，液体不甚透明，即50％凝集
• +：液体混浊，有小的颗粒状物，即25％凝集
• －：液体均匀混浊，无凝集物
• 牛、马和骆驼的血清在
• 0.02ml处或以上凝集，而绵羊、山羊和猪的血清在
• 0.04ml处或以上凝集，判为阳性反应；
• 牛、马和骆驼的血清在
• 0.04ml处凝集，绵羊、山羊和猪的血清在
• 0.08ml处凝集时判为可疑反应
• 大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用
• 0.04和
• 0.02ml，猪、山羊和绵羊、狗用
• 0.08和
• 0.04ml
• 如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集时，均需用四个血清量重检
• 六）每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照
• 二、试管凝集反应
• 一）每份血清用4支试管（1×8cm），另取对照管3支
• 如待检血清多时，只设一份对照组
• 二）按表8-2，用
• 0.5％石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度
• 第五管中不加血清，设抗原对照
• 第六管中加1：25稀释的布氏杆菌阳性血清
• 0.5毫升作阳性对照
• 第七管中加1：25稀释的布氏杆菌阴性血清
• 0.5毫升作阴性对照

第2页：三）各管中加入用

• 三）各管中加入用
• 0.5％石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌抗原
• 0.5ml（每ml含菌8亿）
• 四）各管加抗原后，将各管充分混匀，放37℃温箱中感作4～10小时，取出后放室温18～24小时，然后观察并记录结果
• 五）检查猪、羊、狗时血清稀释度为1:25，1:50，1:100，1:200；
• 绵羊、山羊血清用10％浓盐水稀释
• 牛、马和驼骆血清稀释度为1:50，1:100，1:200，1:400，大规模检疫可只用两个稀释度，即狗、猪、羊为1:25，1:50；
• 牛、马、骆驼为1:50和1:100
• 判定结果时用“十”表示反应强度：++++：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状（即100％的菌体被凝集）
• +++：液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状（75％菌体被凝集）
• ++：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50％菌体被凝集）
• +：液体不透明，仅管底有少许凝集，其余无显著的凝集块（25％菌体被凝集）
• －：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊
• 表8-2
• 六）当每份待检血清仅用2个稀释度进行试验时，无论任何一个稀释度发生凝集现象，该血清都应该用四个稀释度重检
• 七）判定血清凝集价：出现“++”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价
• 牛、马和骆驼血清凝集价1:100以上为阳性，1:50为可疑
• 猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为1:50以上为阳性，1:25可疑
• 三、间接血球凝集试验（以结核病为例）
• 一）致敏红血球的制备
• 1.无菌采取绵羊血于阿氏液中，于4℃冰箱保存备用（保存期3周）
• 用时用生理盐水洗涤3次
• 2.用pH
• 7.4PBS稀释旧结核菌素15～60倍，每6毫升稀释的结核菌素加沉淀血清
• 0.1毫升
• 混合后置37℃水浴2小时，每15分钟振摇1次，以防血球沉降
• 3.用生理盐水洗涤致敏红血球3次后稀释成
• 0.25％血球悬液
• 二）间接凝集反应：
• 1.取被检血清1毫升加等量洗涤后的沉积红血球，室温作用10分钟后，离心除去红血球，以吸收非特异性凝集素
• 56℃灭活30分钟
• 0.5％石炭酸生理盐水

第3页：2.按表8-3分别加入各种成分

• 2.按表8-3分别加入各种成分
• 3．按管底血球沉降图形判定凝集程度
• 血球凝集于管底呈伞状，轻轻振荡后血球呈颗粒状或絮片状者为+++；
• 血球集中沉淀于管底呈小园点，轻摇后呈均匀混浊者为－；
• 介于二者之间的判为++和+
• 本法诊断结核病有特异性，可诊断活动性结核
• 如多次检查凝集价显著升高者（升高4倍以上），可判为活动性结核