33 实验十二 酶联免疫吸附试验（ELISA）.doc

第1页：实验十二 酶联免疫吸附试验 目的要求与原

• 实验十二酶联免疫吸附试验（ELISA）目的要求1.掌握ELISA的基本原理2.熟悉ELISA（间接法）的操作方法原理在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原—抗体免疫复合物；在一定的底物参与下，免疫复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成另一种带色物质，由于在一定条件下，酶的降解底物和呈现色泽是成正比的，因而可以通过比色测定，进而计算出参与反应的抗原或抗体的含量。ELISA方法发展很快，每年都有新的创造和改进,ELISA类型也很多，但操作方法都大体相似。本实验以经典的ELISA间接法测定猪旋毛虫抗体为例，说明ELISA的基本操作方法和原理。操作步骤一、材料准备（一）器材聚苯乙烯40孔平底反应板、加样器、滴管、滤纸、微量混合器、酶标分光光度计等。（二）试剂1.包被液（CB，0.05MpH9.6碳酸盐缓冲掖）Na2CO3NaHCO3蒸馏水加至1.59g2.93g1000ml2.稀释液（PBS，0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液）72mlNa2HPO4溶液）A液（0.2M28mlNaH2PO4溶液）B液（0.2M18g2000mlNaCl加蒸馏水至注：A液配制：71.64gB液配制：31.2gNa2HPO4
• 12H2O溶解在1000ml蒸馏水。NaH2PO4溶解在1000ml蒸馏水3.洗涤液（PBST，0.05％吐温PBS，PH7.4）81.0ml19.0ml0.5ml8.5g1000mlA液（0.2MNa2HPO4）B液（0.2MNaH2PO4）吐温（Tween-20）NaCl加蒸馏水至该液4℃冰箱保存备用。4.底物溶液（临用时配制，棕色瓶避光保存）。邻苯二胺0.2MNaH2PO42％无水柠檬酸液37％H2O2蒸馏水加至40mg25.7ml29.3ml0.15ml100ml5.终止液（2MH2SO4）用蒸馏水将10.8ml浓硫酸稀释至100ml（注意应是硫酸滴入水中）。6.酶标抗体兔抗猪IgG辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体或酶标葡萄球菌A蛋白（酶

第2页：实验十二 酶联免疫吸附试验 操作步骤与结

• 标SPA），自制或购买
• 7.标准抗原自制或购买
• 8.标准阴、阳性血清自制或购买
• 9.检样采集的猪血清
• 二、操作步骤
• 一）抗原包被抗原用pH
• 9.6的碳酸盐缓冲液作适当稀释（购买者，按说明书；
• 自制者，需事先进行滴定）后包被，每孔加200μl，放湿盒置4℃冰箱过夜
• 二）洗涤次日甩干（甩干洗涤液，下同）用pH
• 7.4PBST洗涤三次，每次3分钟（3×3′），每次洗涤时，先将上次洗涤液甩干
• 三）加血清将被检血清作1:80稀释（全血作1:10稀释），每份血样做两孔，每孔加100μl，同时加入1:100阳性血清和1:80阴性血清各两孔作对照，置湿盒放37℃温箱作用30分钟
• 四）洗涤同步骤
• 二）
• 五）加酶标抗体（或酶标SPA）甩干，每孔加入酶标抗体（或酶标SPA）100μl，37℃湿盒作用30分钟
• 六）洗涤同步骤
• 二）
• 七）加底物每孔加底物溶液100μl，37℃湿盒作用30分钟
• 八）终止反应每孔加入2MH2SO4溶液（终止液）各一滴
• 九）比色肉眼或用酶标分光光度计比色
• 结果判定肉眼观察液体里黄色或棕褐色者为阳性反应,无色者为阴性反应
• 分光光度计比色选用492nm的波长比色，见被检血清OD值高于标准阴性血清平均OD值二倍以上者为阳性反应，否则为阴性反应