04 实验四 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）.ppt

第1页：大肠杆菌感受态的制备

实验名称

大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）

所属课程

分子生物学实验

第2页：实验四内容目录

本实验内容

• 实验目的
• 实验原理
• 实验仪器、材料与试剂
• 实验步骤
• 实验结果与讨论

第3页：实验四 实验目的

• 学习 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞。

第4页：感受态细胞制备原理

受体菌株

用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

感受态形成

受体细胞经电击法、CaCl2 等化学试剂法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。

第5页：实验四 实验仪器

（一）仪器

• 恒温摇床
• 超净工作台
• 高压灭菌锅
• 低温离心机
• 微量取液器

第6页：

第7页：

第8页：实验四 实验材料

（二）材料

• 大肠杆菌 DH 5α。

第9页：实验四 试剂

（三）试剂

• LB液体培养基；
• 0.1 mol/L CaCl2 溶液。

第10页：感受态制备步骤（一）

实验步骤

1. 挑取大肠杆菌 DH 5α 的单菌落，接种于 5 ml LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养 14 hr；
2. 取 2 ml 菌液加入 100 ml LB 液体培养基中，扩大培养约 2～3 h；测 OD600 值，当 OD600 约 0.4～0.5 时停止培养；
3. 菌液冰上放置 10 min，无菌条件下移入 50 ml Beckman 离心管中，4℃、3,500 rpm 离心 5 min。

第11页：感受态制备步骤（二）

4. 弃上清，在冰浴上加入 8 ml 预冷的无菌 CaCl2（0.1 mol/L），轻摇使细胞悬浮，冰上放置 5 min；
5. 4℃、3,500 rpm 离心 5 min；
6. 弃上清，用 1 ml 预冷的无菌 CaCl2（0.1 mol/L）重新悬浮细胞，200 μL/份分装到预冷的无菌 Ep 管中，4℃ 保存备用（如加入 15% 的甘油，-70℃ 保存，可保存一年）。

第12页：实验四结果与讨论

实验结果与讨论

• 感受态细胞长时间处在常温状态会严重影响转化率，应尽量减少常温操作，动作要迅速；
• 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈；
• 尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。